[發(fā)明專利]一種T7核酸內(nèi)切酶I的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410141111.4
• 申請(qǐng)日: 2014-04-09
• 公開（公告）號(hào): CN104974993A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李華平;張金闊;錢柳青;范名俊;朱苗苗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州復(fù)能基因有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/22
• 分類號(hào): C12N9/22;C12N15/70
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 劉宇峰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種核酸內(nèi)切酶的制備方法。

背景技術(shù)

T7核酸內(nèi)切酶I是一種多功能核酸酶，可特異識(shí)別并拆分重組中間體（Holiday?Junction，HJ）交叉結(jié)構(gòu)，隨機(jī)切刻雙鏈DNA，特異識(shí)別并切割雙鏈DNA中的切刻和單堿基錯(cuò)配位點(diǎn)。

該酶蛋白是T7噬菌體基因3編碼產(chǎn)物，由包含149個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈構(gòu)成，兩條肽鏈通過結(jié)構(gòu)域交換形成同源二聚體，其催化中心由來自兩個(gè)亞基的氨基酸側(cè)鏈共同組成，兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域可以獨(dú)立作為DNA切刻酶；通過結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同作用，表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)特異性催化。作為一種已知的噬菌體類解離酶，該酶可以剪切分叉DNA，隨機(jī)切刻線性DNA，識(shí)別并切刻nicked-DNA位點(diǎn)，識(shí)別單堿基錯(cuò)配位點(diǎn)，T7核酸內(nèi)切酶I對(duì)HJ的結(jié)合具有高度特異性，其結(jié)合HJ的能力是結(jié)合線性雙鏈DNA的1000倍左右，還具備隨機(jī)在雙鏈DNA中引入切刻位點(diǎn)的活性，專一性識(shí)別切刻位點(diǎn)并在另一條DNA鏈上對(duì)應(yīng)位置引入另一切刻位點(diǎn)導(dǎo)致DNA雙鏈的斷裂，專一性識(shí)別并切割DNA雙鏈中的單堿基錯(cuò)配位點(diǎn)。該酶應(yīng)用廣泛，具有作為工具酶的重要價(jià)值。主要的商業(yè)用途包括：可用于分支DNA結(jié)構(gòu)的解離，基因組測(cè)序技術(shù)和DNA-shuffling技術(shù)中DNA的前處理，SNP的檢測(cè)等。

目前制備T7核酸內(nèi)切酶的方法是：將蛋白分別表達(dá)合成出兩段肽鏈，在體外融合而成。采用IMPACT-TWIN蛋白純化系統(tǒng)純化與MBP融合表達(dá)的截短型無活性T7核酸內(nèi)切酶I（tT7Endo?I），該融合蛋白的C-端帶有硫酯鍵。然后體外合成一段合成肽，其中含有被前者截下來的氨基酸，將該合成肽與融合蛋白的C-端硫酯鍵相連接，形成全長(zhǎng)具有活性的T7核酸內(nèi)切酶I。最后，再用因子Xa將MBP融合頭切去，純化得到全長(zhǎng)的野生型T7核酸內(nèi)切酶I。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種核酸內(nèi)切酶的制備方法，該方法操作簡(jiǎn)便、易于規(guī)模化生產(chǎn)，并能有效節(jié)約成本。

本發(fā)明所述的一種T7核酸內(nèi)切酶的制備方法，包括以下步驟：

（a）T7核酸內(nèi)切酶的表達(dá)載體的構(gòu)建；

（b）將不含有終止密碼子的編碼序列插入到步驟a所獲得的蛋白表達(dá)載體中；以及

（c）采用與標(biāo)簽相適應(yīng)的純化方法，獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)即T7核酸內(nèi)切酶。

根據(jù)本發(fā)明所述的T7核酸內(nèi)切酶的制備方法的進(jìn)一步特征，所述表達(dá)載體包括：用于插入目的蛋白即T7核酸內(nèi)切酶的編碼序列的識(shí)別和切割位點(diǎn)；在所述識(shí)別和切割位點(diǎn)的上游具有如SEQ?ID?NO:1所示的gIIIs信號(hào)肽編碼序列，其前面是起始密碼子；在所述識(shí)別和切割位點(diǎn)的下游具有His6標(biāo)簽，其后面是終止密碼子。

優(yōu)選地，所述的識(shí)別和切割位點(diǎn)為BsaI識(shí)別及切割位點(diǎn)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：構(gòu)建N端帶M13噬菌體蛋白III的前導(dǎo)序列（gIIIs）的載體，合成出來的信號(hào)肽能引導(dǎo)蛋白分泌出核外，在細(xì)胞周質(zhì)中表達(dá)，對(duì)細(xì)胞本身的基因組無毒性，故能直接在體內(nèi)表達(dá)出可溶并有生物活性的T7核酸內(nèi)切酶I。這種生產(chǎn)方法簡(jiǎn)便易操作，易于規(guī)模化生產(chǎn)，并能有效節(jié)約成本。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述方法獲得的T7核酸內(nèi)切酶I能特異地識(shí)別DNA片段中不匹配的位點(diǎn)，并在這此位點(diǎn)附近進(jìn)行切割。其切割效率與商品化的T7核酸內(nèi)切酶I相當(dāng)，活性良好。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所述方法操作更為簡(jiǎn)便、易于規(guī)模化生產(chǎn)，并能有效節(jié)約成本。

附圖說明

圖1是T7核酸內(nèi)切酶I的NI柱層析電泳圖；圖中，S：層析前樣品；X：穿過樣品；Elution：線性洗脫收集峰。

圖2是T7核酸內(nèi)切酶I的Heparin柱層析電泳圖；圖中，S：層析前樣品；X：穿過樣品；Elution：線性洗脫收集峰。

圖3是T7核酸內(nèi)切酶I的Hitrap?SPP柱層析電泳圖；圖中，S：層析前樣品；X：穿過樣品；Elution：線性洗脫收集峰。

圖4是反應(yīng)產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中，M：100-3000bp?DNA?Marker；1：加入NEB?T7核酸內(nèi)切酶I（NEB?Catalog#M0302）的陽(yáng)性對(duì)照；2：加入純化后的T7核酸內(nèi)切酶I；3：不加任何酶，加入ddH2O作為陰性對(duì)照；圓點(diǎn)：T7核酸內(nèi)切酶I識(shí)別后切開所形成的條帶，長(zhǎng)度分別在480bp及330bp左右。

具體實(shí)施方式