[發(fā)明專利]研究腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移、增殖、分化的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410140961.2
• 申請(qǐng)日: 2014-04-10
• 公開（公告）號(hào): CN103940985A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 段維明;張永鑫;楊春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 首都醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/53
• 分類號(hào): G01N33/53;G01N33/533
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 宋焰琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地本發(fā)明涉及一種研究腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移、增值、分化等影響的方法。?

背景技術(shù)

帕金森病(Parkinson’s?disease，PD)是一種常見的以黑質(zhì)紋狀體通路病變?yōu)橹饕卣鞯闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性退變性疾病。目前PD的發(fā)病機(jī)制尚未明確，是多種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果。臨床上的療法都不能從根本上阻止PD病人黑質(zhì)紋狀體通路的進(jìn)行性退變，近來越來越多的人認(rèn)為啟動(dòng)腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞參與腦損傷修復(fù)很可能發(fā)展成為一個(gè)嶄新的治療腦損傷的策略。這一治療策略尤其適用于修復(fù)慢性腦損傷疾病-帕金森病。?

目前經(jīng)典藥物治療如口服左旋多巴（L-dopa）在初期可以減輕或緩解癥狀，但并不能延緩病程的進(jìn)展，且長期使用有明顯的副作用，即L-dopa誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)障礙。外科手術(shù)如深部腦刺激下丘腦核也只能暫時(shí)減輕或緩解癥狀。這些療法都不能從根本上阻止PD病人黑質(zhì)紋狀體通路的進(jìn)行性退變，啟動(dòng)腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞參與PD腦損傷修復(fù)是一個(gè)嶄新的治療慢性腦損傷的策略。?

神經(jīng)發(fā)生就是指神經(jīng)元發(fā)育的整個(gè)過程，從一個(gè)前體細(xì)胞分裂開始，一直到新的神經(jīng)元成熟、整合并具有功能的過程。神經(jīng)前體細(xì)胞能自我更新，但多處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)CNS受損或變性時(shí)，細(xì)胞微環(huán)境發(fā)生改變，NSCs被激活，發(fā)生增殖、遷移、分化、整合，促進(jìn)神經(jīng)元再生及損傷部位腦組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。成年腦有兩個(gè)神經(jīng)生發(fā)區(qū)，在那里神經(jīng)再生比較活躍：一個(gè)是側(cè)腦室傍邊的腦室管膜下區(qū)（SVZ）；一個(gè)是海馬的粒細(xì)胞下區(qū)（SGZ）。這兩個(gè)部位神經(jīng)干細(xì)胞所產(chǎn)生的未成熟的神經(jīng)細(xì)胞（Neuroblast）有各自的傳統(tǒng)遷移通路，SVZ所產(chǎn)生的未成熟神經(jīng)細(xì)胞形成細(xì)胞簇，沿著嘴側(cè)遷移流（RMS）遷移到嗅球、分化成中間神經(jīng)元；SGZ?所產(chǎn)生的未成熟神經(jīng)細(xì)胞則遷移到海馬齒狀回的粒細(xì)胞層，分化成中間神經(jīng)元加入到神經(jīng)回路中。揭示這些細(xì)胞遷移的分子機(jī)制和規(guī)律將會(huì)給引導(dǎo)這些細(xì)胞向腦損傷區(qū)遷移提供重要的理論依據(jù)。大量研究發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞的共同特點(diǎn)是細(xì)胞表面均表達(dá)很高水平的唾液酸化神經(jīng)細(xì)胞粘附因子。當(dāng)這些細(xì)胞到達(dá)目的地、分化成成熟中間神經(jīng)元后，細(xì)胞表面的PSA表達(dá)就會(huì)消失，提示PSA-NCAM在未成熟神經(jīng)細(xì)胞定向遷移中起重要的作用。有實(shí)驗(yàn)表明如果將Endo-N注射到側(cè)腦室，傳統(tǒng)遷移通路RMS就會(huì)遭到破壞，SVZ所產(chǎn)生的未成熟神經(jīng)細(xì)胞則向其他腦組織包括紋狀體異位遷移明顯增多。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種研究腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移、增殖、分化的方法，為研究腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移、增殖、分化等影響提供一種有效的方法。?

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的研究腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移、增殖、分化的方法：?

1）對(duì)動(dòng)物腦切片進(jìn)行BrdU（5溴脫氧尿嘧啶）和DCX（雙腎上腺皮質(zhì)激素）、BrdU和NeuN（神經(jīng)元核心抗原）、BrdU和GFAP（膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子）雙標(biāo)免疫熒光染色，以及PSA-NCAM（唾液酸化神經(jīng)細(xì)胞粘附因子）單標(biāo)免疫熒光染色；?

2）使用GraphPad?Prism6.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)并繪圖，BrdU陽性細(xì)胞為單因素多組數(shù)據(jù)使用one-way?ANOVA分析。?

所述的方法中，動(dòng)物腦切片經(jīng)過以下處理：在腦右側(cè)紋狀體內(nèi)立體定位注射6-OHDA（6-羥多巴胺）溶液后，在側(cè)腦室注射Endo-N（PSA特異性裂解酶）原液，再腹腔注射BrdU溶液。?

所述的方法中，動(dòng)物腦切片是指動(dòng)物左右腦切片。?

所述的方法中，所述動(dòng)物腦切片中包括有對(duì)照組腦切片。?

所述的方法中，所述對(duì)照組腦切片是立體定位注射6-OHDA溶液后，在側(cè)腦室注射PBS緩沖液，再腹腔注射BrdU溶液。?

所述的方法中，所述動(dòng)物腦切片腹腔注射BrdU溶液是連續(xù)注射數(shù)天。?

所述的方法中，所述統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)的結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SEM）表示，以p<0.05作為在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的界限。?

本發(fā)明的方法可以用于研究神經(jīng)干細(xì)胞的遷移特點(diǎn)，分析6-OHDA損傷的紋狀體中的遷移來的細(xì)胞的分化能力，為進(jìn)一步深入研究如何啟動(dòng)腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移、增殖、分化等影響奠定了重要的工作基礎(chǔ)。?

附圖說明

圖1是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的方法研究路線。?