[發明專利]一種使用多內參基因組合研究胡楊基因的方法

有效

• 申請號: 201410138911.0
• 申請日: 2014-04-08
• 公開（公告）號: CN103898223A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 尹偉倫;夏新莉;王厚領
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 盧新

1.一種使用多內參基因組合研究胡楊基因的方法，其特征在于：包括如下步驟：

（1）對胡楊進行抗逆脅迫處理，并分別提取胡楊在每個處理下的總RNA，反轉錄為cDNA，作為PCR的模板；

（2）使用多個胡楊常用的內參基因，所述內參基因數量大于等于9，設計特異性引物在實時熒光定量PCR儀上選擇SYBR?Green法進行反應，得到CT值；

（3）通過geNorm軟件的PV值計算功能，以0.15為閾值確定所選擇的實驗條件下需要的內參基因的數目n；

（4）根據所需數目選擇內參基因，將選擇的n個內參基因和目的基因一起進行qRT-PCR反應，將得到的CT值通過geNorm軟件，得到目的基因在每個處理下相對表達量的變化數據，采用以下公式計算：

ratio=(Etargetgene)ΔCTtargetgene(min-sample)NormalizationFactor→ratio=(Et)ΔCTtNF]]>

2.根據權利要求1所述的使用多內參基因組合研究胡楊基因的方法，其特征在于：步驟（2）和（4）的PCR體系均為20μl，加樣順序及用量依次為10μl2×SuperReal?PreMix?Plus,

0.3μl20μM正向引物,0.3μl20μM正向引物,1μl?cDNA模板,2μl50×ROX?Reference?Dye△,6.4μl?RNase-free?ddH₂O，反應程序為95℃15min，95℃20s60℃60s循環數45，得到溶解曲線。

3.根據權利要求1或2所述的使用多內參基因組合研究胡楊基因的方法，其特征在于：步驟（2）中使用的內參基因為16個，分別為18S、60S、Actin、Cpn60β、EF1α、eIF-5A、GAPDH、GIIα、HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB和UBQ，16個候選的內參基因引物對的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:32所示。

4.根據權利要求3所述的使用多內參基因組合研究胡楊基因的方法，其特征在于：所述環境脅迫處理為脫落酸處理、寒冷處理、脫水處理、干旱處理、短期鹽脅迫處理或長期鹽脅迫處理中的一種或幾種。

5.根據權利要求4所述的使用多內參基因組合研究胡楊基因的方法，其特征在于：目的基因為PeSCL7，其引物對的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:37～SEQ?ID?NO:38所示，抗脅迫處理方式為脫水處理0、1、3、6、9、12小時，步驟（4）中n=3，3個內參基因分別為HIS、60S和Actin。

6.根據權利要求4所述的使用多內參基因組合研究胡楊基因的方法，其特征在于：步驟（4）中目的基因為PePYL1，PeSCOF-1、PeCDPK6、PeCHY1或PeWRKY1，其中PePYL1，PeSCOF-1引物對的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:33～SEQ?ID?NO:36所示。