[發明專利]耐高滲透壓的重組大腸桿菌及其應用

有效

• 申請號: 201410138473.8
• 申請日: 2014-04-08
• 公開（公告）號: CN104974946B
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 張學禮;朱欣娜;肖孟雍;陳晶;馬延和
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 北京永新同創知識產權代理有限公司 11376
• 代理人: 欒星明;程大軍

本發明涉及通過遺傳工程改造大腸桿菌的領域。具體而言，本發明提供了一種含有突變的rpoB、cusS和/或mreC基因的重組大腸桿菌。本發明還涉及使用所述大腸桿菌用于生產如丁二酸等化工原料的用途。本發明還提供了使用所述大腸桿菌生產丁二酸等化工原料的方法，以及通過引入突變的rpoB、cusS和/或mreC基因而提高大腸桿菌耐滲透壓能力的方法。

發明領域

本發明涉及通過遺傳工程改造大腸桿菌的領域。具體而言，本發明提供了一種含有突變的rpoB、cusS和/或mreC基因的重組大腸桿菌。本發明還涉及使用所述大腸桿菌用于生產如丁二酸等化工原料的用途。本發明還提供了使用所述大腸桿菌生產丁二酸等化工原料的方法，以及通過引入突變的rpoB、cusS和/或mreC基因而提高大腸桿菌耐滲透壓能力的方法。

發明背景

微生物細胞的生理性能是微生物工程菌發酵的核心問題之一。良好的微生物工程菌需要具備以下生理特性：耐受高濃度的葡萄糖、耐受高濃度的產物、耐受高溫和耐受低pH。

微生物細胞為了生存和生長，胞質內的滲透壓保持在280-320mosM，平均為300mosM左右(Higgins et al.1987,Trends Biochem Sci12:339-344)。當培養基溶液的滲透壓高于320mosM，細胞會發生收縮產生質壁分離現象。細胞生長減慢，在低生長速率情況下，大部分的基因會停止表達。大腸桿菌細胞同時會啟動滲透壓調節機制：吸收K⁺，積累脯氨酸，合成海藻糖，甜菜堿等兩性離子化合物等；細胞外膜組分蛋白OmpC的合成增加(Postma et al.1996,Escherichia coli and Salmonella,2rd:1210-1224)。此外，在高滲透壓條件下（23g/L NaCl，滲透壓相當于800mosM），還有40個基因表達上調，107個基因表達下調(Weber et al.2002,J Bacteriol184:5502-5507)，這些基因的表達是否和滲透壓調節相關還有待鑒定。

通過適應性進化可以提高菌株對高滲透壓的耐受性，提高工程菌株的產量和產率。Liu等(Liu et al.2007,Biotechnol Bioeng97:825-832)在70g/l（滲透壓相當于2392mosM）的NaCl中連續培養光滑球擬酵母，篩選得到耐高滲透壓的突變株RS23。相對于野生型，突變株RS23丙酮酸的產量和產率增長41.1%和11.1%。Fang等(Fang et al.2011,World J Microbiol Biotechnol27:3009-3013)采用相同的手段，在42g/l（滲透壓相當于1436mosM）的NaCl中連續培養琥珀酸放線桿菌，篩選得到耐高滲透壓的突變株CH050。相對于野生型，突變株CH050丁二酸的產量和產率增長了37.5%和4.37%。但是，這些研究對菌株耐高滲透壓的基因及相關機制并沒有進行解析。

用無機鹽培養基發酵常常需要葡萄糖作為碳源，在一定范圍內，目標產物 的產量會隨著葡萄糖濃度的增加而增加。但若葡萄糖濃度過高，由于滲透壓過大，將影響菌株的生長和代謝。另外，用中性pH進行有機酸發酵時，發酵產物有機酸鹽會導致高滲透壓，對細胞生長和代謝產生抑制作用。因此，微生物工程菌株對滲透壓的耐受性尤為重要。

發明概述

在一個方面，本發明提供了一種重組大腸桿菌，其含有選自如下的一種或多種突變的基因：(a)突變的rpoB基因，其所編碼的多肽在對應于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的位置D654的位置上含有修飾；(b)突變的cusS基因，其所編碼的多肽在對應于SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的位置G210的位置上含有修飾；和(c)突變的mreC基因，其所編碼的多肽在對應于SEQ ID No.:3所示氨基酸序列的位置G24的位置上含有修飾。

在一個實施方案中，本發明的重組大腸桿菌中所述突變的rpoB基因所編碼的多肽在對應于SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的位置D654的位置上是用Y置換D。