[發明專利]一種體外擴增乳腺干細胞并維持其干細胞特性的方法及其應用在審

申請號：	201410138220.0	申請日：	2014-04-08
公開（公告）號：	CN104974981A	公開（公告）日：	2015-10-14
發明（設計）人：	曾藝;蔡車國	申請（專利權）人：	中國科學院上海生命科學研究院
主分類號：	C12N5/074	分類號：	C12N5/074;A61K35/55;A61P15/14
代理公司：	上海光華專利事務所 31219	代理人：	張艷
地址：	200031 ***	國省代碼：	上海;31
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種體外擴增乳腺干細胞維持特性方法及其應用
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種體外擴增乳腺干細胞并維持其干細胞特性的方法及其應用。

背景技術

干細胞是一類處于未分化狀態、但持有多向分化潛能和自我更新能力的原始細胞，包括胚胎干細胞和成體干細胞兩大類。成體干細胞存在于多種已分化的組織和器官內，能自我更新并增殖、分化成特定組織的功能細胞。離體后的成體干細胞由于缺失了體內特定微環境信號的調控，會喪失自我更新和多向分化的潛能，迅速走向分化。一直以來，制約成體干細胞研究的一個重要瓶頸就是缺乏非常有效的對各種組織特異性干細胞進行體外培養和擴增的方法，其體外擴增和在體外擴增過程中維持其干細胞的特性是非常困難的。目前唯一涉及臨床使用的例子是從燒傷病人的活組織中提取表皮細胞進行培養，但這并不是真正意義上的干細胞培養，因為經過體外培養的這種表皮細胞只能分化成角質細胞。因此成體干細胞體外培養和擴增的技術體系的成功建立將會極大推動著成體干細胞的研究和應用。

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，已成為威脅婦女健康的主要病因。研究證明，激素影響著乳腺的正常發育和乳腺癌的形成，婦女患乳腺癌的風險和其生殖的歷史及激素的分泌都有重要的關聯。然而系統性的激素如何通過局部的信號分子控制乳腺干細胞的自我更新、增殖和影響乳腺癌的發生仍然并不清楚。

現有技術中成體干細胞的體外培養非常困難，尤其突出的是在體外培養時干細胞趨于分化、難以維持其干細胞的特性。以往的研究工作已經證實Wnt信號通路控制著乳腺成體干細胞在體內的自我更新。在此基礎上，將純化的Wnt3A蛋白和3D培養方法結合起來，成功在體外對乳腺干細胞進行了培養和擴增并保持了其干細胞的特性。但是使用這種方法，需要純化的Wnt3A蛋白，而純化具有物學活性的Wnt3A蛋白代價昂貴，因此這種培養方法很難普及到大規模的干細胞體外培養以及后續的藥物篩選中。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種體外擴增乳腺干細胞并維持其干細胞特性的方法及其應用，用于解決現有技術中的問題。

本發明第一方面提供一種體外擴增乳腺干細胞并維持其干細胞特性的方法，所述方法將乳腺管腔細胞與乳腺干細胞進行3D共培養，并在培養過程中加入雌性激素（E2）和/或孕激素（Pg）。

較佳的，所述體外擴增乳腺干細胞并維持其干細胞特性的方法具體如下：

1）細胞3D培養：將分離得到的乳腺管腔細胞和乳腺干細胞按照2.5～3.5:1的比例混合，離心得細胞沉淀并加入基質膠，將含有細胞的基質膠鋪入培養板，待膠體形成后加入細胞培養液，并在細胞培養液中加入雌激素和孕激素后進行3D培養；

2）培養過程中每天更換新鮮培養液，培養5至7天進行傳代；

優選的，所述傳代的具體方法為：去除細胞培養液后加入Dispase酶處理，再加入胰酶處理，然后重懸并離心沉淀，在細胞沉淀中加入基質膠并鋪入培養板中培養，傳代完成。

更優選的，加入Dispase酶處理時，同時進行吹吸使基質膠完全化掉，Dispase酶處理時間為25-35分鐘。

更優選的，胰酶處理時間為5～10分鐘。

更優選的，重懸方法為加入含有5%FBS的PBS重懸。

優選的，所述步驟（1）中，乳腺管腔細胞和乳腺干細胞的比例為3:1。

所述乳腺管腔細胞和乳腺干細胞的比例為細胞數比例。