[發明專利]一種硫氧還蛋白還原酶熒光探針及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201410137070.1
• 申請日: 2014-04-08
• 公開（公告）號: CN104974744B
• 公開（公告）日: 2017-01-04
• 發明（設計）人: 卜憲章;吳海強;黃磊;陳雨
• 申請（專利權）人: 深圳市漢康科技有限公司
• 主分類號: C07D407/06
• 分類號: C07D407/06;G01N21/64;C09K11/06
• 代理公司: 深圳市恒申知識產權事務所(普通合伙)44312
• 代理人: 陳健

技術領域

本發明屬于熒光探針技術領域，具體涉及一種硫氧還蛋白還原酶熒光探針及其制備方法和用途。

背景技術

硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin?reductase，TrxR）是二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸二硫化物氧化還原蛋白酶家族成員。硫氧還蛋白還原酶、硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(triphosphopyridine?nucleotide，NADPH)共同構成了硫氧還蛋白系統，該系統主要作用是調節細胞內氧化還原平衡。大量研究表明硫氧還蛋白還原酶在多種人原發性腫瘤中過表達，是腫瘤異常增生的關鍵調控酶，可以作為腫瘤標志物檢測其在人體內的活性，從而監測體內腫瘤的發生和發展。因此一種能特異性檢測硫氧還蛋白還原酶表達量的熒光探針有十分重要的臨床意義。

硫氧還蛋白還原酶的活性位點是碳端一段保守的序列(-Gly-Cys-Sec-Gly)，其中Cys497，Sec498對其還原活性起到關鍵作用。大量文獻表明，許多含有α，β-不飽和酮結構的化合物能抑制硫氧還蛋白還原酶的活性。姜黃素作為一種被廣泛研究的化合物，依賴它結構中的α，β-不飽和酮，表現出較好的硫氧還蛋白還原酶抑制活性。其抑制作用機制是姜黃素分子通過邁克爾加成反應共價結合到該酶的Cys497，Sec498。本課題組從事硫氧還蛋白還原酶抑制劑的研究多年，通過大量結構的分析，發現呋喃丙烯酰結構是硫氧還蛋白還原酶抑制的藥效團。

目前，文獻報道只有一種含有環狀二硫鍵的熒光探針分子用于檢測硫氧還蛋白還原酶。然而，該熒光探針是非共價結合的。因此一種新的能共價結合到硫氧還蛋白還原酶，實現原位定點檢測的熒光探針將會有更廣泛的應用價值。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種可與硫氧還蛋白還原酶共價結合，具有較高檢測特異性的硫氧還蛋白還原酶熒光探針。

本發明采用的技術方案是提供一種硫氧還蛋白還原酶熒光探針，所述熒光探針為(E)-7-(二乙胺基)-3-(3-(5-甲基呋喃-2-基)丙烯酰)-2氫-苯并吡喃-2-酮，其結構式為：

本發明的目的還在于提供所述硫氧還蛋白還原酶熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

步驟一：4-二已胺基水楊醛用溶劑溶解后，加入乙酰乙酸乙酯和哌啶，攪拌并加熱回流，冷卻后過濾獲得中間體化合物；

步驟二：取所述中間體化合物，用溶劑溶解后，加入5-甲基呋喃醛及哌啶，攪拌并加熱回流，冷卻后柱層析分離獲得所述硫氧還蛋白還原酶熒光探針。

本發明的目的還在于提供所述硫氧還蛋白還原酶熒光探針的用途，將所述硫氧還蛋白還原酶熒光探針應用于檢測硫氧還蛋白還原酶及同家族酶、同工酶、結構相似酶的活性、含量。

本發明的目的還在于提供所述硫氧還蛋白還原酶熒光探針的用途，將所述熒光探針應用于制備硫氧還蛋白還原酶及同家族酶、同工酶、結構相似酶的檢測試劑、檢測試劑盒。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

（1）以呋喃丙烯酰基為藥效團，以香豆素作為熒光團而設計的熒光探針，對于硫氧還蛋白還原酶作用的專一性強。

（2）本發明熒光探針自身熒光信號很弱，與硫氧還蛋白還原酶作用后熒光顯著增強，并且，該熒光探針能與硫氧還蛋白還原酶共價結合，熒光不會被稀釋，檢測靈敏度高。

（3）本發明硫氧還蛋白酶還原酶自身化學性質穩定，無自氧化作用，與目標物作用迅速且作用后無光漂白現象。

（4）本發明所提供制備方法合成路線簡單，易于制備，便于推廣應用。

本發明硫氧還蛋白還原酶熒光探針性能優異，為進一步研究細胞中硫氧還蛋白還原酶生物學功能提供了可靠實用的工具。

附圖說明

圖1為本發明硫氧還蛋白還原酶熒光探針檢測原理示意圖；

圖2為本發明實施例3中硫氧還蛋白還原酶熒光探針與硫氧還蛋白還原酶反應的紫外可見吸收光譜圖；

圖3為本發明實施例4中硫氧還蛋白還原酶熒光探針與不同濃度的硫氧還蛋白還原酶反應的熒光發射光譜圖；

圖4為本發明實施例5中硫氧還蛋白還原酶熒光探針與不同物質作用的熒光強度變化柱狀圖；

圖5為本發明實施例6中硫氧還蛋白還原酶熒光探針與硫氧還蛋白還原酶及其它含巰基化合物反應的熒光強度的動力學曲線圖；

圖6為本發明實施例7中硫氧還蛋白還原酶熒光探針與待檢測細胞內硫氧還蛋白還原酶的熒光成像圖。

具體實施方式