[發明專利]一種含有更多絲氨酸的谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體及其制備方法

有效

• 申請號: 201410136649.6
• 申請日: 2013-07-18
• 公開（公告）號: CN103898073A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 宋健;魏景艷;郭笑
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08;C12N15/70
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 張景林;王恩遠

1.一種含有更多絲氨酸的谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ?ID?No:2所示。

2.一種含有更多絲氨酸的谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ?ID?No:5所示。

3.權利要求1所述的含有更多絲氨酸的谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體，其步驟如下：

1）、表達載體的構建：

根據氨基酸序列SEQ?ID?No:1，用DNA合成儀人工合成能在營養缺陷型菌株中表達GPX1突變體蛋白的基因，確保靶基因的5′端含有起始密碼子ATG，3′端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點，確保靶基因的49位硒代半胱氨酸SeCys的編碼序列替換為半胱氨酸Cys的密碼子，第87位丙氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子，且基因全長不含有ACA序列；然后用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的GPX1突變體基因和分泌型原核表達載體，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX1突變體基因組裝到分泌型原核表達載體上；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而GPX1突變體基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化：

用步驟1）中構建的含有GPX1突變體基因的表達載體轉化營養缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受態細胞，涂含Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株；再將含有表達核酸內切酶MazF的pMazF質粒轉化陽性菌株，用含雙抗性的M9固體培養基篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有SeCys、必需生長因子和營養素的培養基里，經IPTG低溫4-25℃誘導表達，營養缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，直接表達出在底物GSH的結合部位含有SeCys的GPX1突變體，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質的表達；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX1突變體蛋白，透析凍干后即得GPX1突變體蛋白純品，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE和蛋白印跡Western?blot鑒定目標蛋白。

4.權利要求2所述的含有更多絲氨酸的谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體的制備方法，其特征在于：是在序列SEQ?ID?No:2的氨基端引入pColdI原核表達載體的組氨酸純化標簽和凝血因子Xa切割位點的氨基酸后所形成序列SEQ?ID?No:5。