[發明專利]一種黑根霉及其應用技術

在審

• 申請號: 201410136456.0
• 申請日: 2014-04-08
• 公開（公告）號: CN104893982A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發明（設計）人: 楊曉亮;周德群;趙月華;王錢鋼
• 申請（專利權）人: 麗江映華生物藥業有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P1/02;C12R1/845
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 趙云

技術領域

本發明屬于工業真菌技術領域，具體設計一種高產甾體發酵黑根霉菌株及其甾體化合物發酵的應用技術。

背景技術

1甾體化合物C11α-羥化微生物發酵。

???甾體化合物是一類含有環戊烷多氫菲核的化合物，由于母核上取代基、

???雙鍵位置或立體構型的不同，形成了一系列具有獨特生理功能的化合物。

羥化反應是甾體微生物轉化中最重要的反應，C11羥基對于甾體藥物的抗炎活性起到積極的作用。微生物能在甾體的任何位置進行羥基化反應。化學方法除了較易在C17引入羥基外，在其他位置都很難引入。自1952年美國普強（Upjohn）藥廠Peterson和Murry最早發現黑根霉（Rhizopus?nigricans）對甾體具有C11α-羥化反應后，我國黃鳴龍教授等于1958年用黑根霉使16a，17a-環氧黃體酮氧化引入C11-a羥基，從而研究成功從薯蕷皂素合成可的松的七步法路線，并一直沿用至今。

目前，工業上用于甾體C11α-羥化轉化反應的微生物主要有黑根霉（Rhizopus?nigricans?Ehrenb.）、赭曲霉（Aspergillusochraceus）以及綠僵菌（Metarhiziumspp.）等。對于甾體C11α-羥化反應，工業上依然大量使用黑根霉，因為黑根霉性狀穩定，發酵雜質少，單雜含量低，發酵技術成熟，轉化率和得率也較穩定。而經過多年選育后的黑根霉，通過投料方式等方面改進，在轉化率上比以往提高了1倍，相比其他C11α-羥化反應菌種，轉化率過低的劣勢得到了改善。依靠菌種選育手段的不斷更新，黑根霉在甾體C11α-羥化反應中，還將扮演重要角色。

2黑根霉的分類地位及利用現狀。

黑根霉（Rhizopusnigricans）屬于真菌界（Fungi），接合菌門（Zygomycota），毛霉目（Mucorales），根霉科（Rhizopodaceae）。

在用本菌株催化底物沃氏氧化物進行11α-羥基化反應，葡萄糖與糊精作為培養基碳源時的轉化率較高。其中，葡萄糖較易被微生物利用并轉化成菌體生長所需的能量和碳成分，且價廉易得，廣泛應用于微生物實驗和工業化生產．因此，選用葡萄糖為最佳碳源。

通常黑根霉在15～35℃條件下都能生長，其中以25～30℃為最適生長溫度。菌絲生長和孢子形成的最適溫度為28～30^oC。黑根霉生長發育要求空氣相對濕度在90％以上。孢子的存活受物理和化學因素的影響。

發明內容

本發明目的是提供一種黑根霉新菌株，其生產霉菌氧化物具有轉化率高、收率高，而且生物學性狀比較穩定等特點，可以為以薯蕷皂甙為原料的植物甾體激素生產提高產量、降低生產成本提供技術支持。

本發明的另一目的是提供所述黑根霉新菌株的在以沃氏氧化物為底物制備霉菌氧化物中的應用。

本發明的再一目的是提供所述黑根霉新菌株在以沃氏氧化物為底物生產霉菌氧化物的方法。

實現本發明上述目的采取的技術方案是：所述黑根霉菌株屬于真菌界，接合菌門，毛霉目（Mucorales），根霉科，，菌種保藏于“中國普通微生物菌種保藏管理中心”，保藏時間為2013年06月08日，保藏號為：CGMCC?No.7687。

該所述的黑根霉菌株CGMCC?No.7687在以沃氏氧化物為底物制備霉菌氧化物中進行應用。

本發明所述生產霉菌氧化物的方法包括以下步驟：

⑴原種復活：在原種生長溫度條件下，在酵母膏瓊脂培養基試管斜面上培養，直到氣生菌絲長滿斜面并出現大量黑色分生孢子；

⑵制備菌懸液：取無菌水倒入培養好的試管斜面中，用接種針攪拌打下氣生菌絲上的孢子制備成菌懸液，再取菌懸液稀釋后，涂布在酵母膏瓊脂培養基平板上，在生長溫度條件下培養；

⑶制備試管斜面：在培養的酵母膏瓊脂培養基平板上選擇單個菌落接種在酵母膏瓊脂培養基試管斜面上，在生長溫度條件下培養；

⑷制備種子液：將試管斜面培養的菌種制備成菌懸液并移入已經滅菌的搖瓶培養液中，在生長溫度條件下，在搖床上培養，獲得種子液；

⑸投料發酵：投入沃氏氧化物到種子液中搖瓶發酵培養，在菌種生長條件下，培養得到發酵液；

⑹結果檢測：將每個搖瓶的發酵液經“煮沸-抽濾-粉碎-加入丙酮蒸發-回流-再抽濾-濃縮-結晶”程序后，將結晶物抽濾得到粗制品和母液，將粗制品烘干稱取粗制品重量，根據投料量計算粗制品收率和轉化率；