[發明專利]一種用于檢測大田軟海綿酸的基于磁性納米粒子修飾的酶傳感器及制備方法

在審

• 申請號: 201410135515.2
• 申請日: 2014-04-04
• 公開（公告）號: CN104977339A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發明（設計）人: 袁高峰;孫海燕;方旭波;金標旺
• 申請（專利權）人: 浙江海洋學院
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/26
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛

1.一種用于檢測大田軟海綿酸的基于磁性納米粒子修飾的酶傳感器，包括絕緣性基體、形成在該基體上的含有工作電極、參比電極和對電極的電極系統，其特征在于，所述工作電極上固定有生物酶層，該生物酶層包括磁性納米粒子修飾的蛋白磷酸酶2A（PP2A）以及電子傳遞體，所述磁性納米粒子的直徑為250nm～350nm。

2.如權利要求1所述的酶傳感器，其特征在于，所述磁性納米粒子為鎳修飾磁性納米粒子，而所述PP2A酶蛋白質鏈氨基末端修飾有能與所述鎳修飾磁性納米粒子共軛鏈接的hexa-His。

3.如權利要求2所述的酶傳感器，其特征在于，所述鎳修飾磁性納米粒子的直徑為300nm。

4.如權利要求1所述的酶傳感器，其特征在于，所述電子傳遞體為對硝基苯磷酸二鈉鹽。

5.如權利要求1或2或4所述的酶傳感器，其特征在于，所述參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為石墨電極。

6.一種如權利要求2所述的用于檢測大田軟海綿酸的基于磁性納米粒子修飾的酶傳感器的制備方法，其特征在于，首先將鎳修飾的磁性納米粒子與所述PP2A酶偶聯吸附連接形成磁性納米粒子修飾的PP2A酶，然后將該磁性納米粒子修飾的PP2A酶通過光交聯法或瓊脂糖包埋法固定在所述工作電極上。

7.如權利要求6所述的酶傳感器的制備方法，其特征在于，所述鎳修飾的磁性納米粒子與所述PP2A酶偶聯吸附連接包括以下步驟：

（1）將15～30ul的Ni-IDA磁性納米粒子膠狀懸浮液加入到預裝有150～300ul結合緩沖液的容器中，并用所述結合緩沖液清洗，以去除非特異性結合，所述結合緩沖液的pH為8-8.5，含有Tris–HCl、NaCl以及疊氮化鈉；

（2）將1～2個單位PP2A酶/ul的PP2A酶溶液加入到所述容器中，以600～1000轉/min的轉速震搖所述容器10-20min，以使所述磁性納米粒子與所述PP2A酶充分偶聯吸附結合形成磁性納米粒子修飾的PP2A酶，所述PP2A酶溶液與所述NI-IDA磁性納米粒子膠狀懸浮液的體積比為50～100:3，所述1單位PP2A酶為在25℃下1min內裂解所述對硝基苯磷酸二鈉鹽所需的酶量；

（3）用所述結合緩沖液清洗所述磁性納米粒子，以去除未結合的所述PP2A酶。

8.如權利要求7所述的酶傳感器的制備方法，其特征在于，所述結合緩沖液為pH7.5的20mM?Tris溶液，該Tris溶液含有500mM?NaCl和0.09%疊氮化鈉。

9.如權利要求6所述的酶傳感器的制備方法，其特征在于，所述光交聯法包括以下步驟：

（1）將所述磁性納米粒子修飾的PP2A酶溶解在pH8～8.5緩沖液A中制成1～2個單位/ul的固定酶溶液，在該酶溶液中加入PVA-AWP，所述PP2A酶與所述PVA-AWP的質量比為1～2:1，均質后形成固定溶液，所述緩沖液A包含Tris–HCl、EDTA以及MgCl₂，所述1單位磁性納米粒子修飾的PP2A酶為在25℃下1min內裂解所述對硝基苯磷酸二鈉鹽所需的酶量；

（2）然后滴加2.5～3.5ul所述固定溶液至工作電極表面，3～5℃下在功率為12～15W的日光燈下照射3～6h；

（3）光照后，3～5℃下干燥12～24h，干燥后用雙蒸水沖洗，以去除物理吸附的多余的磁性納米粒子修飾的PP2A酶，最后將制得的固定化磁性納米粒子修飾的PP2A酶電極在4℃下保存備用。

10.如權利要求6所述的酶傳感器的制備方法，其特征在于，所述瓊脂糖包埋法包括以下步驟：

（1）將0.1～0.2g瓊脂糖加入到50～100ml?pH為8～8.7的Tris–HCl緩沖液中，55～65℃加熱4～6min，充分溶解后得瓊脂糖溶液，待該瓊脂糖溶液降溫至20～27℃時，將磁性納米粒子修飾的PP2A酶加入到瓊脂糖溶液中并充分混合形成混合液，該混合液中磁性納米粒子修飾的PP2A酶的濃度為1～2個單位PP2A酶/ul，其中所述1單位磁性納米粒子修飾的PP2A酶為在25℃下1min內裂解所述對硝基苯磷酸二鈉鹽所需的酶量；

（2）上述混合液3～5℃放置11～13h后，取2.5～3.5ul滴涂于所述工作電極表面，室溫下干燥成膜5～6h；

（3）干燥后用雙蒸水沖洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，最后將制得的固定化磁性納米粒子修飾的PP2A酶電極在4℃下保存備用。