[發明專利]一種用于N-糖蛋白去糖基化的糖苷酶及其應用

有效

• 申請號: 201410134277.3
• 申請日: 2014-04-02
• 公開（公告）號: CN104974994B
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發明（設計）人: 陳力;孫桂芹;策力木格
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;C12N9/22;C12P21/02;C12N9/08
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

本發明屬于糖生物學研究領域，具體涉及一種新型N?糖苷酶，該新型N?糖苷酶命名為二型PNGase F，PNGaseF?II。本發明的N?糖苷酶能夠將不同糖鏈結構類型（高甘露糖型糖鏈、復合型糖鏈、雜合型糖鏈）的N?糖蛋白上的糖鏈完整切除，并且它能夠切除α?1,3?核心巖藻糖化的N?糖蛋白的糖鏈，而已有的N?糖苷酶F（PNGase F）對α?1,3?核心巖藻糖化的N?糖蛋白沒有酶切活性。本發明的酶對N?糖蛋白有較為廣泛的底物和有較高的實際應用價值。本發明的新型N?糖苷酶還可以用于N?糖鏈結構分析、糖鏈的功能分析，為糖生物學以及生物醫藥的研究提供一種新的工具酶。

技術領域

本發明屬于糖生物學領域，涉及病原生物學、分子生物學、生物化學，具體涉及新型糖苷酶、其應用和使用方法。

背景技術

1.糖基化

糖基化是蛋白質翻譯后修飾中最主要的修飾之一，在蛋白質翻譯調控、蛋白質降解等過程中起著非常重要的作用(1)。50％以上的蛋白質以糖蛋白的形式存在，并且越來越多的研究表明，糖基化異常可導致人類疾病(2)。在臨床治療過程中，使用的抗體藥物均帶有糖基化(3)。

根據蛋白質與糖鏈連接方式的不同，糖基化可以大致分為四種類型：N-連接糖基化、O-連接糖基化、C-甘露糖糖基化和糖基磷脂酰肌醇(glycophosphatidly inositol,GPI)錨定連接。O-連接糖基化是指寡糖鏈與Ser、Thr、羥基賴氨酸或羥脯氨酸的羥基相連(4)，例如如人血纖維蛋白溶酶原、人免疫球蛋白IgA等。C-甘露糖糖基化是指甘露糖基通過C-C鍵連接到色氨酸吲哚環2號位C上(5)，例如膠原。糖基磷脂酰肌醇錨定連接，GPI錨的一般結構主要是由乙醇胺、糖核心和肌醇連接而成，肌醇最終通過磷酸基團與細胞膜中的磷脂結構相連，乙醇胺則與蛋白質的羧基端相連，糖沒有直接和蛋白質連接而是通過乙醇胺磷酸鹽橋接于核心聚糖(6)，例如細胞表面受體、膜蛋白。N-連接糖基化是寡糖鏈(GlcNAC的β-羥基)與Asn的酰胺基氨基形成N-連接糖蛋白(5)，例如人免疫球蛋白、轉鐵蛋白等。本章重點闡述N-連接糖基化。

N-連接糖基化是研究最多的一種蛋白質的糖基化形式，Asn-X-Ser/Thr結構的(X-脯氨酸外的任意一種氨基酸)Asn酰胺基氨基與寡糖鏈(GlcNAC的β-羥基)N-連接糖蛋白。在動物細胞中，與天冬酰胺連接的糖，幾乎都是N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，而且連接方式總是β構型(7)。N-連接糖有共同的特點是有五糖核心(2個N-乙酰葡糖胺和3個甘露糖)。與DNA和蛋白質相比，糖蛋白糖鏈的結構更加多樣，根據它們的外層鏈(outer chain)結構的不同，可分為：高甘露糖型(high mannose)、雜合型(hybrid type)與復合型(complex type)。三者的區別在于，高甘露糖型只含有多個α-連接的甘露糖殘基，而復雜型含有以巖藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)和唾液糖(SA)為組分的糖鏈殘基，雜合型則兼有兩種特點。在復雜型和雜合型糖鏈中，根據核心巖藻糖連接方式不同，還分為α-1,3連接核心巖藻糖和α-1,6連接核心巖藻糖，結構如圖8所示。

2.去糖基化酶

近年來，糖生物學的研究日益受到生物學家的關注，蛋白質的糖基化修飾和糖蛋白的去糖基化是研究糖蛋白中糖鏈結構和功能的重要手段。目前階段去糖基化的手段主要有酶法、化學法，其中酶法被認為是比較理想的方法，該法能保持蛋白質的完整性，并且適宜于許多糖蛋白。根據切除糖鏈位點，去糖基化酶分為三類：外切型糖苷酶、內切型糖苷酶和N-糖苷酶(N-糖酰胺酶)。

外切型糖苷酶(Exo-glycosidase)是研究最早的一類糖生物學研究的工具酶，能從糖鏈的外端切除糖鏈釋放單個糖，如流感病毒表面的神經氨酸酶(NA)、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶等。

內切型糖苷酶(Endo-glycosidase)都是從糖鏈內部專一性切開某個鍵，因此在糖鏈結構分析以及結構與功能關系研究中非常有用，也是目前糖基化工程中的重要酶，例如常用的Endo F、Endo H。