[發(fā)明專利]一種動態(tài)實時測量細胞膜電位的方法

有效

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• 申請日: 2014-04-03
• 公開（公告）號: CN103954659A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發(fā)明（設計）人: 張鵬;黃辰;張毅奕;馬曉華;郝躍
• 申請（專利權(quán)）人: 西安電子科技大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26
• 代理公司: 北京市京大律師事務所 11321
• 代理人: 張璐;方曉明

技術領域

本發(fā)明涉及一種動態(tài)實時測量細胞膜電位的方法。

背景技術

人體體液流動會對細胞會產(chǎn)生剪應力，進而引起細胞電位的變化。剪切力能影響人體內(nèi)皮細胞生物學特性的許多方面，與多種心血管疾病相關。因此，檢測細胞膜電位是否變化具有重要的生理學和病理學研究意義。

目前，測量剪切力下的細胞膜電位的方法主要包括熒光染料法、微電極陣列法和膜片鉗方法。

熒光染料法是利用熒光強度在剪切力作用下會發(fā)生改變，并且與膜片鉗得到的細胞膜電位變化趨勢相同的性質(zhì)，來測量細胞膜電位的一種方法。但這種方法反應時間和精度都有較大差距，且目前無法證明熒光強度能夠代替細胞膜電位表征細胞的電生理現(xiàn)象。

微電極陣列法采用集成電路硅工藝，通過微電極陣列能夠表征大體積的單個肌細胞或神經(jīng)細胞的動作電位。但這種方法存在測量準備時間長、測量準確度和靈敏度低的缺點。

膜片鉗方法是目前最常用的方法，它是通過玻璃微電極測量單細胞的膜內(nèi)外的電壓或電流差，并通過一定的放大和轉(zhuǎn)換，得到細胞膜電位。但是這種技術具有以下先天性不足：生物組織是由大量細胞緊密排列形成的，而膜片鉗只能測量單細胞，并不能表征實際的多細胞膜電位對剪切力的響應情況；測量時會破壞細胞膜，改變細胞的特性，短時間內(nèi)細胞將死亡，這樣就限制了對細胞膜動作電位以及離子通道早期發(fā)生現(xiàn)象的研究；在流體環(huán)境下測試時，由于剪切力的存在，細胞容易從膜片鉗脫落；膜片鉗技術每次只能記錄一個細胞（或一對細胞），每天只能獲得的數(shù)據(jù)量僅為幾到幾十個，耗時耗力。

綜上所述，熒光染料法、微電極陣列法和膜片鉗方法均無法解決活體多細胞膜電位的測量問題，來準確表征剪切力對細胞膜電位的影響。

因此，需要一種具有檢測快速、靈敏度高、實時測量、結(jié)果準確、生物兼容性高、多細胞活體測量等多重優(yōu)點的方法，來進行細胞膜電位的測量。

發(fā)明內(nèi)容

因此，為解決現(xiàn)有技術中存在的上述問題而完成了本發(fā)明，本發(fā)明的目的之一在于提供一種實時的準確測量剪切力影響的活體多細胞膜電位的方法，該方法使用了氮化鎵（GaN）高電子遷移率晶體管（HEMT）、微流室技術和微注射泵技術，將從人體臍帶靜脈血中分離出來的細胞在體外進行培養(yǎng)，然后注入到微流室中繼續(xù)進行培養(yǎng)，最后利用微注射泵在微流室中進行精確的流量控制，用微流室內(nèi)的HEMT器件測量流體表面的粘滯度，進而計算出細胞膜電位，實現(xiàn)了一種動態(tài)模擬多細胞環(huán)境并實時監(jiān)測流體環(huán)境下的活體多細胞膜電位的方法。

在使用本發(fā)明測量細胞膜電位的過程中，將作為生物傳感器的HEMT器件和微流室、微注射泵、儲液瓶相連，在微注射泵提供動態(tài)流體環(huán)境的前提下，通過HEMT器件實時監(jiān)測流體環(huán)境下的活體多細胞膜電位。

本發(fā)明中應用于生物傳感器的HEMT器件的結(jié)構(gòu)為：底層為藍寶石材料，底層向上依次為1.6μm左右的GaN緩沖層，1.2nm?AlN插入層，8～15nm左右的AlGaN勢壘層和1.5nm?GaN帽層，勢壘層鋁組分在25%～40%之間。帽層以上為Si₃N₄鈍化層，鈍化層中間被蝕刻出一塊長方形槽狀的裸柵區(qū)域，裸柵區(qū)域無電極引出，尺寸在10μm～10mm范圍內(nèi)。

如本領域技術人員所熟知或容易想到的上述HEMT器件的藍寶石襯底也可采用其他具有相似功能的材料，如碳化硅（SiC）材料。

本發(fā)明中HEMT器件的制造工藝為：

（1）臺面刻蝕，采用ICP方法刻蝕異質(zhì)結(jié)材料形成器件的臺面隔離；

（2）淀積源漏極歐姆金屬，采用電子束蒸發(fā)的方法獲得歐姆金屬層，歐姆金屬采用Ti/Al/Ni/Au四層結(jié)構(gòu)，并在830℃下退火形成合金，獲得良好的源漏極歐姆接觸；

（3）采用PECVD方法淀積Si₃N₄材料作為鈍化層；

（4）光刻并采用ICP方法刻蝕Si₃N₄，露出裸柵區(qū)域。