[發(fā)明專利]一種鱘魚精子玻璃化凍融保護液的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410134055.1
• 申請日: 2014-04-04
• 公開（公告）號: CN103931606A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙智媛;趙偉
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南苗王生物科技有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 衡陽市科航專利事務(wù)所 43101
• 代理人: 劉勛階

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種魚類雜交育種的深低溫凍融技術(shù)，特別是一種鱘魚精子玻璃化凍融保護液的制備方法。

背景技術(shù)

保全生物遺傳多樣性及雜交育種的應(yīng)用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中選擇—170℃以下深低溫凍存精子進行魚類的繁衍，是生物技術(shù)創(chuàng)新應(yīng)用的發(fā)展趨勢。但目前，深低溫保存魚類精子也只是高度發(fā)達國家用于實驗室的方法，實際應(yīng)用范圍卻非常有限，其主要原因，是由于許多種魚類精子在冷凍和解凍過程中會發(fā)生重大損害。損害的程度取決于冷凍速率、冷凍保護液以及融凍方法。

不少學(xué)者提出，在深低溫保存凍精的過程中若能實現(xiàn)玻璃化，將更有利于生物遺傳多樣性保全和雜交育種的研究及應(yīng)用，利于珍稀動物的保存。運用玻璃化冷凍的方法，如果能成功地實現(xiàn)低溫保存遺傳物質(zhì)，將造福于人類。

現(xiàn)有的精液冷凍保護方法—緩慢冷凍方法容易形成冰晶，會導(dǎo)致形成胞外冰與胞內(nèi)冰而損傷細胞，加之凍融過程中的晶化再結(jié)晶，影響其成活率，使得這一生物凍存技術(shù)成本昂貴，應(yīng)用效率極低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種鱘魚精子玻璃化凍融保護液的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種鱘魚精子玻璃化凍融保護液的制備方法，包括如下步驟：

按照配比將10%的二甲基酚加入到醫(yī)用生理鹽水中混和均勻，再加入甘露糖醇，混和均勻即可；抗凍保護液的重量配比為:醫(yī)用生理鹽水:10%的二甲基酚:甘露糖醇=100:8-12:6-10。

本發(fā)明的使用方法是：將需凍存的鱘魚精子與抗凍保護液按體積份100:90—120的比例均勻稀釋后，加入8-12體積份的鮮雞蛋黃、45-50體積份的花生四烯酸、?6-10體積份的脂質(zhì)，混勻成精液混合液，用冷凍膠囊盛裝，置于抽屜式冷凍室中冷凍，凍速為-58至-68℃/min，冷凍到-56至-70℃后，再將盛裝有精液混合液的膠囊卸載在盛有液氮的杜瓦罐內(nèi)，控制凍速為-148至-152℃/min，冷凍到-190至-196℃后凍存。

本發(fā)明采用抗凍保護液作為防凍劑，可以使冰相變化時有效地改變冰微粒的面積，極大地改變了精子凍存過程中形成的冰狀形態(tài)，既能削弱和抑制凍精冰粒的產(chǎn)生，又更有效地減小冰微粒在水介質(zhì)中的可溶性，避免結(jié)晶和重結(jié)晶，有效提高凍精的生存活力，融凍后的精子授精于鮮卵，其鮮卵受精接近鮮精授精，受精率可達80-90%，且胚胎發(fā)育良好，降低了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的生產(chǎn)成本，提高了凍精保存的使用價值。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明的詳細結(jié)構(gòu)作進一步描述。

實施例1：

一種鱘魚精子玻璃化凍融保護液的制備方法，包括如下步驟：

按照配比將10%的二甲基酚加入到醫(yī)用生理鹽水中混和均勻，再加入甘露糖醇，混和均勻即可；抗凍保護液的重量配比為:醫(yī)用生理鹽水:10%的二甲基酚:甘露糖醇=100:8:6。

實施例2：

一種鱘魚精子玻璃化凍融保護液的制備方法，包括如下步驟：

按照配比將10%的二甲基酚加入到醫(yī)用生理鹽水中混和均勻，再加入甘露糖醇，混和均勻即可；抗凍保護液的重量配比為:醫(yī)用生理鹽水:10%的二甲基酚:甘露糖醇=100:9:8。

實施例3：

一種鱘魚精子玻璃化凍融保護液的制備方法，包括如下步驟：

按照配比將10%的二甲基酚加入到醫(yī)用生理鹽水中混和均勻，再加入甘露糖醇，混和均勻即可；抗凍保護液的重量配比為:醫(yī)用生理鹽水:10%的二甲基酚:甘露糖醇=100:10:9。

實施例4：

一種鱘魚精子玻璃化凍融保護液的制備方法，包括如下步驟：

按照配比將10%的二甲基酚加入到醫(yī)用生理鹽水中混和均勻，再加入甘露糖醇，混和均勻即可；抗凍保護液的重量配比為:醫(yī)用生理鹽水:10%的二甲基酚:甘露糖醇=100:12:10。