[發明專利]一種雙色熒光標記篩選抗阿霉素心肌毒性活性物質的方法

在審

• 申請號: 201410133776.0
• 申請日: 2014-04-03
• 公開（公告）號: CN103969233A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 程翼宇;趙筱萍;王毅
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明屬于藥物篩選與評價方法領域，具體涉及一種雙色熒光標記篩選抗阿霉素心肌毒性活性物質的方法。

背景技術

阿霉素（Doxorubicin，DOX）是臨床上常用的廣譜抗腫瘤藥物之一，被廣泛地應用于實體瘤、白血病、淋巴瘤、乳腺癌等腫瘤治療。但阿霉素會產生累積性、劑量依賴性的心肌毒性，并進一步發展成不可逆性心肌損傷，最終導致充血性心力衰竭，因此嚴重地抑制了其臨床應用。

阿霉素誘導心肌毒性的機制至今仍未完全闡明，現主要認為阿霉素誘發心肌毒性是多因素共同作用的結果，主要包括自由基損傷、細胞凋亡、線粒體損傷、鈣離子超載、能量代謝改變等，這些因素之間相互聯系，共同導致心臟毒性的產生和發展。

中醫治療心血管疾病的歷史悠久，中藥尤其是中藥復方具備多層面多靶點的整體治療優勢。然而，雖然現在市場上廣泛應用的中成藥臨床效果顯著，但其抗阿霉素誘導的心肌毒性的有效成分以及作用機制還不明確。因此，對這些天然產物進行有效成分的篩選和評價，將有望從傳統中藥中找出新的具有抗阿霉素心肌毒性的活性物質。

目前，對于心肌保護組分的篩選主要是體外針對抗氧化活性的篩選，如DPPH法，MTT法、SOD以及LDH等酶活測定。但這些方法存在著作用時間久、靈敏度低等缺陷，不足以滿足化合物庫以及中草藥中多組分大量篩選的要求。因此，基于細胞熒光圖像的高通量篩選方法成為研究熱點，期望能通過熒光標記細胞或者亞細胞器觀察細胞形態以及細胞器功能的改變，來定量評價物質的心肌保護效果，從而快速篩選出心血管疾病治療藥物。

公開號為CN101982775B的中國專利文獻公開了一種基于細胞熒光圖像的藥物篩選方法，通過控制熒光導致顯微鏡上的高精度可控電動平臺精確走位，應用熒光探針特異性標記細胞、細胞顯微圖像自動獲取、熒光圖像識別及數據生成，通過分析圖像信息來獲取心肌細胞保護作用的相關指標來篩選和評價活性組分。

該方法的不足之處在于，單色熒光標記用于藥物篩選研究時，獲得的信息單一，不利于全面評價化合物對細胞的作用，存在漏篩現象。

目前還未見相關報道介紹以多種熒光染料同時標記細胞，通過細胞熒光成像判定細胞損傷程度和藥物保護效應的高內涵篩選方法。

發明內容

本發明提供了一種雙色熒光標記篩選抗阿霉素心肌毒性活性物質的方法，該方法采用兩種熒光探針同時標記細胞，一次性全方位地判定細胞損傷程度和藥物保護效應。

一種雙色熒光標記篩選抗阿霉素心肌毒性活性物質的方法，包括：

（1）取心肌細胞，加入待篩選物質進行預保護；

（2）預保護完成后，加入阿霉素進行損傷；

（3）向損傷后的心肌細胞中同時加入具有不同激發和發射波長的細胞膜完整性熒光探針與細胞核熒光探針，進行熒光標記；

（4）染色完成后采集、分析細胞熒光圖像，分別計算待篩選物質對心肌細胞細胞膜和細胞核的保護率；

（5）從待篩選物質中篩選出對心肌細胞的細胞膜和細胞核的保護率均大于15%的活性物質。

阿霉素引起心肌毒性的損傷機制主要包括破壞細胞膜的完整性而引起的細胞活力下降，改變細胞線粒體膜電位和誘導細胞凋亡等。基于此，本發明選用了兩種熒光探針，即細胞膜完整性熒光探針與細胞核熒光探針，細胞膜完整性熒光探針用于反映細胞膜的完整性，細胞核熒光探針用于反映細胞核雙鏈DNA的損傷程度。并且兩種熒光探針的激發和發射波長互不相同，便于分別獲取與熒光探針相對應的熒光圖像，互不干擾，單獨判斷待篩選物質對細胞膜、細胞核的保護效果，并與陽性藥物進行對比，最終篩選出對心肌細胞的細胞膜和細胞核均具有較強保護效果的活性物質。

兩種熒光探針同時染色不僅比分別染色節約了一半工作量，減少了細胞和相關實驗耗材的用量，還消除了不同細胞樣品之間的差異引起的試驗誤差，檢測結果更為精確可信。同時，通過同時檢測藥物保護心肌細胞后不同細胞器的損傷程度，可為活性物質對抗阿霉素心肌毒性的作用機制提供有用線索，為后續的驗證實驗奠定更可靠的基礎。

本發明方法可在96孔板上進行，具體包括以下步驟：

（1）取心肌細胞，加入待篩選物質進行預保護；

所述心肌細胞優選為對數生長期細胞，可選用常見的H9c2心肌細胞；細胞密度優選為1～100個/μL（對于96孔板為100～10000個/孔），更優選為20～40個/μL，最優選為40個/μL，適宜的細胞密度有利于染色后檢測熒光強度并進行比較。