[發明專利]羥基酪醇在抗阿霉素心肌毒性中的應用及以羥基酪醇為主要活性成分的藥物組合物

有效

• 申請號: 201410133543.0
• 申請日: 2014-04-03
• 公開（公告）號: CN103961338A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 程翼宇;趙筱萍;王毅
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A61K31/05
• 分類號: A61K31/05;A61P9/00;A61P9/10;G01N21/64
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明屬于藥物篩選與評價方法領域，具體涉及羥基酪醇在抗阿霉素心肌毒性中的應用及以羥基酪醇為主要活性成分的藥物組合物。

背景技術

羥基酪醇是橄欖中的有效成分，在地中海飲食中占有重要地位。在早期的研究中，人們認為是橄欖油的中橄欖苦苷發揮重要作用，經過不斷深入研究發現，橄欖苦苷的水解產物羥基酪醇具有更強的生理活性。其結構簡單，分子量小，具有良好的水溶性和脂溶性，能防止輻射、氧自由基及其他因素對視網膜造成損傷，具有良好的治療和保健功能，受到國內外研究者的廣泛關注。

有研究表明，羥基酪醇可誘導細胞內具有解毒作用的二酶相體系，能防止香煙中有毒成分丙烯醛對視網膜造成的損傷，調節線粒體功能，對視覺具有保護作用，對黃斑性變性等眼部疾病具有改善作用（Zhu Lu，Liu Zhong bo，Feng Zhihui，et al.Hydroxytyrosol protects against oxidative damage by simultaneous activation of mitochondrial biogenesis and phase II detoxifying enzyme systems in retinal pigment epithelial cells[J].J Nutr Biochem，2010，21(11)：1089-1098.）。

公開號為CN101674817B的中國專利文獻公開了羥基酪醇在誘導或增強軟骨修復或軟骨再生中的用途，該申請人發現，羥基酪醇能有效誘導或增強軟骨細胞的增殖，刺激軟骨細胞增殖和提高它們生產細胞外基質組分的能力，進而促進軟骨修復和再生。

申請號為201210203464.3的中國專利文獻公開了羥基酪醇用于改進線粒體功能的用途，該申請人發現，羥基酪醇通過線粒體呼吸鏈復合物的活化和線粒體生物發生的提高改進線粒體功能。

雖然現有技術中已報道羥基酪醇具有多種生物活性，但至今為止還未報道過羥基酪醇能夠減輕阿霉素誘發的心肌毒性。

阿霉素（Doxorubicin，DOX）是臨床上常用的廣譜抗腫瘤藥物之一，被廣泛地應用于實體瘤、白血病、淋巴瘤、乳腺癌等腫瘤治療。但阿霉素會產生累積性、劑量依賴性的心肌毒性，并進一步發展成不可逆性心肌損傷，最終導致充血性心力衰竭，因此嚴重地抑制了其臨床應用。因此尋找獲得抗阿霉素心肌毒性的活性物質對阿霉素的臨床應用具有重要意義。

發明內容

本發明提供了羥基酪醇在抗阿霉素心肌毒性中的應用，申請人研究發現，羥基酪醇對因使用阿霉素而誘發的心肌毒性具有顯著抗性，對心肌細胞具有較強的保護作用。

本發明的羥基酪醇新用途是通過如下方法發現的：

（1）將貞芪扶正顆粒用純水溶解，離心取上清液；

（2）用大孔樹脂將所述上清液依次用水、40%乙醇、95%乙醇洗脫，分別收集各洗脫組分，減壓濃縮至干；

（3）將濃縮后的洗脫組分通過制備液相色譜進行分離，收集各餾分，干燥后作為待篩選物質，備用；

（4）取心肌細胞，加入待篩選物質進行預保護；

所述心肌細胞優選為對數生長期細胞，可選用常見的H9c2心肌細胞；細胞密度優選為1～100個/μL（對于96孔板為100～10000個/孔），更優選為20～40個/μL，最優選為40個/μL，適宜的細胞密度有利于染色后檢測熒光強度并進行比較。

待篩選物質的終濃度可先進行預實驗確定，以不會對心肌細胞產生毒性為宜，預保護時間優選為30～180min，更優選為30min。預保護時間過長可能會影響細胞活力，影響篩選和評價結果。

如未作特殊說明，本發明所述終濃度均是指物質加入到體系中后在總體系中的濃度。

（5）預保護完成后，加入阿霉素進行損傷；

作為優選，阿霉素的損傷濃度為0.3～0.6μM，損傷時間為6～24h。更優選的損傷濃度為0.3μM，損傷時間為24h，以模擬實際臨床應用中阿霉素低劑量致慢性心肌毒性的過程。同時，適宜的損傷濃度和損傷時間可避免心肌細胞過度受損，影響篩選和評價結果。

（6）向損傷后的心肌細胞中同時加入具有不同激發和發射波長的細胞膜完整性熒光探針與細胞核熒光探針，進行熒光標記；