[發明專利]一種油酸分子修飾的納米凝膠包被生物炭基固定化脂肪酶及其制備方法

有效

• 申請號: 201410133510.6
• 申請日: 2014-04-04
• 公開（公告）號: CN103882004B
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 胡朝華;萬順剛;唐曉達;張又弛
• 申請（專利權）人: 中國科學院城市環境研究所;中國科學院寧波城市環境研究中心（籌）
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N11/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及脂肪酶固定化技術領域，尤其涉及一種油酸分子修飾的納米凝膠包被生物炭基固定化脂肪酶及其制備方法。

背景技術

生物酶法合成生物柴油被公認為是一種節能環保型能源技術。生物酶法是以脂肪酶為催化劑，在非水溶液體系中催化動植物油脂（脂肪酸甘油三酯）與短鏈醇合成脂肪酸單烷基酯（即生物柴油），這種催化合成方法具有原料預處理簡單、醇用量少、能耗低、產物分離回收方便以及環境友好等優點。然而，游離的脂肪酶催化活性和使用壽命不足限制了其在催化制備生物柴油中的應用。許多策略如脂肪酶分子修飾和酶固定化技術已經被用于改善脂肪酶在非水溶液體系中的催化活性和穩定性。酶固定化技術由于能提高脂肪酶的催化性和重復使用效率，明顯降低酶催化工藝的成本，因而已成為制備生物柴油的關鍵技術之一。

傳統的脂肪酶固定化材料，包括已商業化的固定化脂肪酶Novozym435所采用的大孔丙烯酸樹脂，往往采用惰性的無機或有機材料（在中國專利公開號CN1844382A、CN101280297A、CN101381721A、CN101613690A、CN102191236A、CN103468668A中均有介紹），這些酶固定載體及其固定化過程缺乏可調控性。與傳統的惰性載體相比，智能化高分子材料（如溫度敏感型水凝膠）是一類理想的酶固定載體，其在增加酶負載量、保持酶分子構象和催化活性、以及提高固定化酶再利用性等方面具有重要的應用價值。我們前期研究表明，聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠（PNIPAAm）及其共聚物是一類具有溫度敏感性的智能水凝膠（Hu等，Journal of Materials Chemistry. 2009），在33℃左右體積劇烈變化并產生相分離，這個溫度被定義為較低臨界溶液溫度（LCST）。當外界環境溫度低于LCST，PNIPAAm水凝膠通過溶脹作用大量吸水；反之，外界溫度高于LCST時，水凝膠劇烈收縮并將所吸收于凝膠內部的水排出，這種獨特的“溶脹吸水/收縮排水”特性已被廣泛用于負載酶等生物大分子。在非水相中，固定化脂肪酶分子表層是否保持適度水分是穩定酶活性構象的關鍵環節之一。酶蛋白分子表面通過氫鍵結合作用吸附著一層水分子，這些水分子對酶活性構象起到平衡和穩定作用，并且調節酶分子與底物的結合以及酶分子與產物的分離。因此，利用這類溫敏性水凝膠有望實現固定化脂肪酶表層水分含量的可調可控。

生物炭是一種低成本、多功能的環保材料，已被廣泛用于溫室氣體減排、退化土壤改良、以及重金屬和有機污染物的環境修復等領域,目前有關生物炭載體用于固定化脂肪酶的研究尚未見報道。因此，結合采用生物炭和溫敏性高分子凝膠，研新型脂肪酶固定化載體與固定化技術具有創新性和必要性，新型固定化脂肪酶及其制備方法對于安全、高效轉化生物柴油具有重要的實際應用價值。

發明內容

因此，針對以上內容，本發明提供一種油酸分子修飾的納米凝膠包被生物炭基固定化脂肪酶及其制備方法，采用該方法進行處理的脂肪酶的催化活性得到大幅度的提高。

為達到上述目的，本發明是通過以下技術方案實現的：一種油酸分子修飾的納米凝膠包被生物炭基固定化脂肪酶的制備方法，包括以下步驟：將茅草生物質碳化成生物炭基質，采用油酸分子修飾的納米凝膠對所述生物炭基質表面進行包被，包被后的生物炭基質與脂肪酶溶液充分接觸，對脂肪酶進行界面活化與交聯固定，冷凍干燥后獲得固定化脂肪酶。

進一步的改進是：所述茅草生物碳的碳化條件為初步限氧熱裂解后，繼續在氮氣保護下以3～10℃/min的升溫速率加熱到400～900℃，再炭化1～4h。

進一步的改進是：所述油酸分子修飾的納米凝膠采用熱引發自由基聚合反應合成，反應液的投料組分分別為：功能單體N-異丙基丙烯酰胺、油酸鈉，交聯單體N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺，乳化劑曲拉通，以及引發劑過硫酸鈉。

進一步的改進是：按以下方法制備油酸分子修飾的納米凝膠包被生物炭基質：取油酸修飾的聚N-異丙基丙烯酰胺納米膠乳液，加入茅草生物炭，25℃攪拌混勻1～12h，60～80℃加熱1～6h，過濾收集沉淀，60℃真空干燥。

進一步的改進是：脂肪酶進行界面活化與交聯固定的處理步驟包括：將脂肪酶溶于磷酸緩沖液中，接著與油酸分子修飾的納米凝膠包被生物炭基質反應1～7h，接著加入濃度為0.5～5wt%的戊二醛的磷酸緩沖液，25～50℃下磁力攪拌20～200min。

進一步的改進是：所述的脂肪酶為豬胰脂肪酶、假單胞菌脂肪酶、伯克霍爾德菌脂肪酶、假絲酵母脂肪酶、根霉脂肪酶、曲霉脂肪酶中的任意一種。