[發(fā)明專利]一種檢測EGFR基因858密碼子突變的試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410133017.4
• 申請日: 2014-04-03
• 公開（公告）號: CN103882137A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張戈
• 申請（專利權(quán)）人: 長沙三濟(jì)生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種用于定性或定量檢測血清或血漿中是否含有EGFR858密碼子突變型基因的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

EGFR表皮生長因子受體（EGFR）是原癌基因C-erbB-1（HER-1）的表達(dá)產(chǎn)物，定位于細(xì)胞膜上。目前已經(jīng)報道不下30種EGFR基因突變與藥物反應(yīng)性有關(guān)，但絕大部分是外顯子19上的缺失突變和外顯子21上L858R的點(diǎn)突變。通過對患者EGFR基因的突變檢測，可輔助臨床醫(yī)生篩選可受益于分子靶向抗腫瘤藥物如易瑞沙、特羅凱和凱美納等的腫瘤患者。

臨床上大都采用病理組織標(biāo)本提取DNA進(jìn)行EGFR檢測，但晚期肺癌病人有時無法獲取腫瘤標(biāo)本。很多權(quán)威研究認(rèn)為腫瘤組織存在異質(zhì)性，腫瘤組織不同部位的體細(xì)胞基因突變譜并不相同，血清或血漿腫瘤基因突變檢測方便在不同時間點(diǎn)獲取樣本，沒有空間抽樣偏差，已逐漸在臨床上推廣應(yīng)用。近年來的研究還表明，癌癥病人的血漿中能否檢測到癌細(xì)胞逸出的突變DNA，以及分析血漿中腫瘤基因含量的變化，可以為腫瘤的療效監(jiān)測及預(yù)后提供重要的參考。

采用血清或血漿檢測EGFR基因突變檢測的是來源于腫瘤組織的體細(xì)胞突變，不同于檢測一般性的遺傳突變；在血清或血漿中存在大量野生型DNA，相當(dāng)一部分患者其血清或血漿的EGFR基因突變比例在1%-0.01%之間。目前臨床上逐漸采用的突變基因特異擴(kuò)增PCR法（ARMS）對于EGFR基因858密碼子點(diǎn)突變的檢測靈敏度一般只能達(dá)到1%，不能很好地適用于血清或血漿EGFR基因突變檢測。ARMS也稱作等位基因特異性PCR(AlleleSpecific?PCR，AS-PCR)，其原理是PCR引物的3’端末位堿基與其模板DNA存在錯配時，一般將導(dǎo)致擴(kuò)增效率急劇下降，設(shè)計(jì)等位基因特異性PCR擴(kuò)增引物，在嚴(yán)格的條件下，只有在引物3’堿基與模板配對時才能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增信號，從而檢測出突變。

肽核酸（Peptide?Nucleic?Acid,PNA）由丹麥科學(xué)家在1991年最先先成。PNA是具有類多肽骨架的DNA類似物，主鏈骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸與核酸堿基通過亞甲基羰基連接而成的。PNA/DNA雜交的TM值比DNA/DNA高15℃，但PNA與DNA若有單堿基錯配，則結(jié)合能力很弱或不結(jié)合。PNA鉗制PCR檢測基因突變的原理是：通過設(shè)計(jì)一條涵蓋突變位點(diǎn)的15-20bp長的PNA，其序列與野生型序列完全匹配，當(dāng)PCR的模板為野生型時，PNA與其完全匹配，引物延伸受阻，擴(kuò)增可受到強(qiáng)烈地抑制作用；而當(dāng)PCR的模板為突變型時，PNA與其存在錯配，雜交能力消失，引物延伸不受影響，擴(kuò)增可以正常進(jìn)行。據(jù)文獻(xiàn)報道，采用PNA鉗制PCR技術(shù)檢測基因突變的靈敏度一般在1%左右，同樣不能較好地適用于血清或血漿EGFR基因突變檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測EGFR基因858密碼子突變的試劑盒及其引用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

所述檢測EGFR基因858密碼子突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下成分：

擴(kuò)增野生型和突變型EGFR基因的通用引物對：

上游引物5’-ACACCGCAGCATGTCAAGAT-3’（SEQ?ID?NO:1），

下游引物5’-CTCCTTACTTTGCCTCCTTCT-3’（SEQ?ID?NO:2）；

擴(kuò)增突變型EGFR基因的ARMS引物：

5’-AAGATCACAGATTTTGGGCG-3’（SEQ?ID?NO:3）；

與野生型EGFR基因配對的PNA：

NH₂-GTTTGGCCAGCCCAAA-COOH（SEQ?ID?NO:4）。

上述這些引物都可用于制備檢測EGFR基因858密碼子突變試劑。

下面對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：

本發(fā)明設(shè)計(jì)了一對用于擴(kuò)增野生型和突變型EGFR基因的PCR通用引物，一條用于擴(kuò)增EGFR基因858密碼子突變基因的ARMS引物，一條用于阻滯野生型EGFR基因的擴(kuò)增的PNA；利用PCR通用引物、ARMS引物和PNA，使用含有SYBR染料的反應(yīng)液，對已知突變量的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測，根據(jù)CT值，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出樣本中的突變EGFR基因含量。