[發明專利]檢測氟喹諾酮類藥物的酶聯免疫試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201410132469.0
• 申請日: 2014-04-03
• 公開（公告）號: CN104977406B
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發明（設計）人: 馮才偉;徐念琴;馮靜;崔海峰;馮才茂;賈芳芳;楊昌松;楊爍
• 申請（專利權）人: 北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/544
• 分類號: G01N33/544
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及酶聯免疫檢測技術，具體涉及一種用于檢測氟喹諾酮類藥物的酶聯免疫試劑盒，可定性、定量檢測蜂蜜、雞肉、豬肉、魚、蝦、牛奶、奶粉和雞蛋樣本中氟喹諾酮類藥物藥物的殘留量。

背景技術

氟喹諾酮類藥物因其抗菌譜廣、抗菌活性強，已成為臨床上常用的抗菌藥物，但由于藥物本身特性及不合理用藥和濫用藥物現象的存在，引起了一系列的不良反應。常見的有皮膚過敏及光敏反應、中樞神經系統反應、循環系統反應、消化系統反應、泌尿系統反應、呼吸系統反應、軟骨毒性、肝臟毒性、生殖毒性、跟腱炎和局部刺激癥狀等，養殖業將其作為添加劑飼養動物，使該類藥物在動物體內有一定殘留量，因此對人類健康造成了一定的危害。美國、歐盟、中國等都對氟喹諾酮類藥物的殘留限量做出了規定。

目前，氟喹諾酮類藥物殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質譜/質譜法等儀器方法。這些方法具有靈敏度高、結果準確等優點，但是資金和人員等投入成本較高。本發明應用酶聯免疫法，測定蜂蜜、雞肉、豬肉、魚、蝦、牛奶、奶粉和雞蛋中氟喹諾酮類藥物藥物的殘留量，具有檢測限低、特異性強、操作簡便、檢測速度快、檢測成本低，非常容易推廣等優點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能夠檢測蜂蜜、雞肉、豬肉、魚、蝦、牛奶、奶粉和雞蛋樣本中氟喹諾酮類藥物殘留量的酶聯免疫試劑盒，并提供一種高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測方法。

本發明試劑盒，它包括：包被有包被原的酶標板、氟喹諾酮類藥物標準品溶液、酶標二抗、氟喹諾酮類藥物特異性抗體、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液，所述包被原為氟喹諾酮類藥物偶聯抗原，所述酶標二抗為酶標記的羊抗鼠抗抗體。

所述氟喹諾酮類藥物偶聯抗原是由氟喹諾酮類半抗原與載體蛋白偶聯得到，所述氟喹諾酮類半抗原是由諾氟沙星和羧甲基羥胺反應得到，所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原。

所述氟喹諾酮類藥物特異性抗體是以氟喹諾酮類藥物偶聯抗原作為免疫原制備獲得，所述氟喹諾酮類藥物特異性抗體可為氟喹諾酮類藥物單克隆抗體或氟喹諾酮類藥物多克隆抗體，其中優選氟喹諾酮類藥物單克隆抗體。

所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶，其中優選辣根過氧化物酶；酶標二抗是采用改良后的過碘酸鈉法進行偶聯得到的。

為了更方便現場監控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括氟喹諾酮類藥物標準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液。

所述氟喹諾酮類藥物標準品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.1μg/L、0.4μg/L、1.6μg/L、6.4μg/L、25.6μg/L。

當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成，A液為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，所述終止液為1～2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，所述底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液，所述終止液為1～2mol/L氫氧化鈉溶液。

所述洗滌液優選為pH值為7.4，含有0.5%～1.0%吐溫-20、0.01‰～0.03‰疊氮化鈉防腐劑、0.1～0.3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。

所述復溶液優選為pH值為7.0、0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。

所述蜂蜜樣本稀釋液為pH值為7.0、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。

其中在酶標板制備過程中所用到的包被緩沖液為pH值為9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，封閉液為pH值為7.1～7.5，含有1%～3%酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。

本發明中酶標板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成20μg/ml，每孔加入100μl，25℃避光孵育2h或4℃過夜，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封閉液，25℃避光孵育1～2h，傾去孔內液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。

本發明的檢測原理為：