[發(fā)明專利]一種檢測大腸桿菌O157:H7核苷酸片段的引物和探針序列

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410132107.1
• 申請日: 2014-04-02
• 公開（公告）號: CN103866035A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張雪寒;何孔旺;欒曉婷;汪偉;溫立斌;李彬;王小敏
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.一種用于檢測大腸桿菌O157:H7核苷酸片段的引物和探針序列，引物包括：

上游引物pZF：gccaggcaaatatgtttgtga

下游引物pZR：catttggcatttgaacgatgaa；

探針pZP：cctggataccgctactcaaattctgtcaaaat。

2.權(quán)利要求1所述引物和探針序列用于檢測大腸桿菌O157:H7核苷酸片段的方法，該方法不適用于疾病診斷檢測，包括：

1）待檢模板的制備：

取糞便或者食物10克，加入到90mL磷酸鹽緩沖液中，37℃震蕩2h后，取1mL加入到9mL心腦浸出液培養(yǎng)基中；如待檢樣品為液體，則直接取1mL加入到9mL心腦浸出液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中再加入100?uL?濃度為50mg/mL新生霉素，37℃繼續(xù)培養(yǎng)18h，吸取1mL培養(yǎng)物，500?r離心15min，棄沉淀，吸取上清至新離心管，12000r離心10min，棄上清，取沉淀重懸于1/10體積雙蒸水中，沸水浴10min，4℃12000轉(zhuǎn)離心10min，吸取上清，即檢測用模板DNA；

2）大腸桿菌O157:H7實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系：

組分????????????????????????用量/終濃度

Premix?EX?Taq?2×????????????????12.5μL

引物???????????????????????????0.4μmol/L

探針???????????????????????????0.2μmol/L?

Rox?II??????????????????????????0.5μL

模板????????????????????????????1μL

ddH₂O?????????????????????????9.5μL

將加好樣品的PCR管放置熒光PCR儀中，按下列反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)過程為：95℃?10min，預(yù)變性；95℃?10?s，60℃?1min，40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)時(shí)監(jiān)測；

大腸桿菌O157:H7實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測結(jié)果判定：經(jīng)檢測，顯示陽性擴(kuò)增曲線，則待檢樣品中含有大腸桿菌O157:H7；無擴(kuò)增信號，則待檢樣品不含有大腸桿菌O157:H7。