[發(fā)明專利]一種雙價(jià)DNA疫苗連接肽及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410132066.6
• 申請(qǐng)日: 2014-04-02
• 公開（公告）號(hào): CN103864902A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡勤學(xué);閻巖;胡凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所
• 主分類號(hào): C07K14/00
• 分類號(hào): C07K14/00;C12N15/79;A61K48/00;A61P31/12
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程和免疫學(xué)領(lǐng)域，更具體涉及一種雙價(jià)DNA疫苗連接肽，還涉及到該連接肽在制備雙價(jià)DNA疫苗中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

雙價(jià)DNA疫苗是指采用基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)將兩種基因連接后形成融合的DNA分子，將目的基因?qū)爰?xì)胞后可以單獨(dú)或融合地翻譯出雙功能的蛋白分子，可使機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫的生物制劑。

兩基因用連接子(linker)或直接連接，使用同一個(gè)開放閱讀框，翻譯產(chǎn)生嵌合的一個(gè)雙功能融合蛋白分子，一般的方法是將第一個(gè)基因的終止密碼刪除，其讀碼框與第二個(gè)基因的起始密碼或5’UTR連接并能正確通讀。適當(dāng)?shù)倪B接子有利于兩蛋白的正確折疊及產(chǎn)生各自獨(dú)立的功能，從而實(shí)現(xiàn)理論上的翻譯水平的等量表達(dá)。連接子的設(shè)計(jì)方法多種多樣，多選擇為中性疏水氨基酸，如富含甘氨酸和絲氨酸的多肽鏈，它的長(zhǎng)度對(duì)蛋白質(zhì)的折疊和穩(wěn)定性非常重要，這種方法的主要問題是：①很可能由于構(gòu)象的改變使其中一個(gè)或兩個(gè)基因的功能受到影響；②若兩個(gè)基因產(chǎn)物有不同的細(xì)胞定位，也會(huì)影響基因的正常功能，即基因的功能并不平衡。

趨化因子是動(dòng)物體內(nèi)正常存在的分子，副反應(yīng)小，作為基因佐劑可以誘導(dǎo)改變免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和類型，目前已發(fā)現(xiàn)多種趨化因子具有佐劑效應(yīng)，但其詳盡的作用機(jī)制尚不是十分清楚。CCL19和CCL28通過不同的作用環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)或增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效應(yīng)而發(fā)揮佐劑作用。CCL19的主要作用是招募T細(xì)胞至二級(jí)淋巴器官的T細(xì)胞區(qū)域，從而促進(jìn)T細(xì)胞的活化、增殖。其配體分子CCR7也表達(dá)于活化的B細(xì)胞和DC細(xì)胞，因而CCL19-CCR7信號(hào)可以促進(jìn)B細(xì)胞、DC細(xì)胞和T細(xì)胞在二級(jí)淋巴組織中的相互作用。此外也有文獻(xiàn)報(bào)道CC?L19可以增強(qiáng)抗腫瘤應(yīng)答以及HSV-1特異性的免疫應(yīng)答。CCL28的配體分子有CCR3和CC?R10，其廣泛表達(dá)于許多黏膜部位的上皮細(xì)胞，可以招募分泌IgA抗體的漿細(xì)胞從淋巴組織遷移至多種黏膜部位，CCL28作為基因佐劑已用于流感疫苗的研發(fā)中，且具有廣譜的抗菌活性，研究發(fā)現(xiàn)CCL28也可以增強(qiáng)HIV蛋白的免疫應(yīng)答能力，其潛在的機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。

HSV-2目前還沒有理想的疫苗，最常用的生產(chǎn)疫苗的方法就是用病毒的包膜糖蛋白作為免疫原制成的疫苗，常用的有g(shù)D和gB，但其產(chǎn)生的中和抗體的速度慢、中和病毒的能力較低、半衰期較短，有僅能保護(hù)血清陰性的人群且不能保護(hù)男性等不足。由連接肽制備的雙價(jià)疫苗可以提高佐劑和抗原的表達(dá)效率，兩種基因表達(dá)時(shí)形成三聚體，可在實(shí)現(xiàn)蛋白等量表達(dá)的同時(shí)又提高了免疫原性；同時(shí)根據(jù)佐劑的配體分子的分布特點(diǎn)可以定向的將抗原分子提呈給二級(jí)淋巴組織中的T或DC細(xì)胞識(shí)別，產(chǎn)生高效的細(xì)胞免疫反應(yīng)。Mark?Melchers等人的研究發(fā)現(xiàn)通過幾種linker連接的CD40L和HIV-1Env蛋白，IZ基序(GCN4)可以使Env蛋白的三聚體構(gòu)象更加穩(wěn)定同時(shí)促進(jìn)了樹突狀細(xì)胞的成熟及增加了細(xì)胞因子的分泌，從而提高了抗體的中和能力。

鑒于以上研究，為了使表達(dá)包膜糖蛋白基因和佐劑基因的融合蛋白形成更加穩(wěn)固的空間構(gòu)象，并且發(fā)揮出各自獨(dú)立的功能，本發(fā)明對(duì)IZ基序進(jìn)行延長(zhǎng)，在其前后加入了一段有疏水性和一定伸展性的肽鏈(G4S)₂，可以最大限度地緩解兩種蛋白相互干擾作用，連接后能夠正常地在體細(xì)胞內(nèi)翻譯、折疊，并且可以形成蛋白三聚體，免疫后也獲得了滿意的結(jié)果。該重組的雙價(jià)DNA疫苗具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性、而且能夠更迅速地產(chǎn)生高滴度的抗體、較強(qiáng)的中和病毒能力、并對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效果好。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在于提供了一種雙價(jià)DNA疫苗連接肽，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1所示，所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為SEQ?ID?NO.2所示。病毒包膜糖蛋白基因和佐劑基因通過該連接肽（(G4S)₂-IZ-(G4S)₂）連接后能夠正常地在體細(xì)胞內(nèi)翻譯、折疊，并且可以形成蛋白三聚體。

本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供了一種雙價(jià)DNA疫苗連接肽在制備雙價(jià)DNA疫苗中的應(yīng)用。利用該DNA疫苗連接肽制備的疫苗質(zhì)量易于控制，易大規(guī)模生產(chǎn)，易保存和運(yùn)輸，成本低。所形成的雙功能融合的蛋白分子不但增強(qiáng)了DNA疫苗的免疫原性，同時(shí)還實(shí)現(xiàn)了病毒包膜糖蛋白基因和佐劑基因在同一細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，免疫小鼠后能夠更迅速地產(chǎn)生高滴度的抗體，且具有較強(qiáng)的抗體中和能力，并對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效果好。