[發明專利]單核細胞增生性李氏桿菌的檢測方法及其專用單克隆抗體

有效

• 申請號: 201410130271.9
• 申請日: 2014-04-02
• 公開（公告）號: CN104099299A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 駱學農;才學鵬;王佩雅;朱學亮;王芳;張少華
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/12;G01N33/577;G01N33/569;C12R1/91
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 張秋云

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技術領域

本發明涉及單核細胞增生性李氏桿菌的檢測方法及其專用單克隆抗體。?

背景技術

單核細胞增生性李斯特菌(?Listeria?monocytogenes，LM)?簡稱單增李斯特菌，是一種能引起人畜共患病和食源性疾病的致病菌，該菌屬于細胞內寄生的革蘭氏陽性桿菌，人畜感染后，主要表現為腦膜炎、敗血癥和血液中單核細胞增多等癥狀，死亡率達20～30%，該菌在自然界廣泛存在，食品中存在的單核細胞增生性李斯特菌對人類安全構成很大威脅，是21世紀對人類健康具有重大影響的12種病原微生物之一。?

李氏桿菌屬包括單增李氏桿菌（Listeria?monocytogenes）、伊氏李氏桿菌(L.ivanovii)、無害李氏桿菌(L.innocua)、威斯梅爾氏李氏桿菌(L.Welshimeri)、西里杰氏李氏桿菌(L.seeligeri)。除L.M對人畜致病性高外，其它的都致病力很小或無致病力，而且在自然界中普遍存在。因此，如何區分食品污染的是致病性李氏桿菌還是其它常在李氏桿菌，是食品工業或動物李氏桿菌病免疫學診斷的首要課題。目前，傳統的L.M檢測方法因細菌分離、增菌以及鑒定所需時間較長，花費人力物力較大，不適合快速檢測的需要，其他檢測方法，如PCR法、基因探針等方法，需要昂貴的實驗儀器,?而且特異性差，因此很不適合在現場對大量樣品進行檢測，如何提高L.M的檢出率的同時縮短檢測時間已經成為各國科技工作者急需解決的問題。?

國內外一些學者對單增李斯特菌單克隆抗體的制備以及ELISA檢測方法進行了很多研究，Boerlin等學者用重組的LLO和inl?A作為EL?ISA?診斷抗原檢測牛的L?M抗體,?結果敏感性特異性分別達82%?和92%，說明用基因工程生產的抗原建立的ELISA?方法完全可以用于LM?的診斷和檢測。Vazquez-?Boland?J?A等學者用純化的重組溶血素蛋白包被聚苯乙烯板，利用間接ELISA?的方法已經成功的檢測出綿羊感染的單核增生性李斯特桿菌,?并且抗原的包被條件和其他反應條件已經被優化。崔煥忠等人以致病性李斯特菌ActA蛋白為對象，原核表達了ActA?蛋白，制備了抗ActA?特異性單克隆抗體，并從中選取2株單克隆抗體分別用于免疫膠體金標記和膠體金試紙檢測線的包被，從而研制成了檢測LM?的膠體金試紙。秦玉敏用純化的重組LLO蛋白免疫小鼠，獲得6株穩定分泌抗LLO單克隆抗體的雜交瘤細胞株，以制備的腹水單抗為診斷抗體，用此診斷抗體分別與BHI培養基和TSB-YE培養基培養的不同時段的LMO上清發生反應，建立了阻斷ELISA檢測LMO的方法。但這些研究大都以ActA、LLO等為研究對象，有關p60的單克隆抗體及檢測試劑盒的研究目前還很少。Yu等篩選出了抗p60的單克隆抗體，建立了檢測單增李氏桿菌的ELISA方法。該方法雖然快速簡單，但敏感性和特異性與間接ELISA相當，也不能進行定量分析。?

發明內容

本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種可快速檢測食品及動物體內致病性單核細胞增多性李氏桿菌的檢測方法。?

為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為：小鼠骨髓瘤細胞與脾細胞的雜交瘤細胞株6C2，其保藏編號為CGMCC?No.8768。?

小鼠骨髓瘤細胞與脾細胞的雜交瘤細胞株6C2，已于2014年3月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址，北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC?No.8768。?

本發明的第二個目的，是提供了單核細胞增生性李氏桿菌p60單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCC?No.8768的小鼠骨髓瘤細胞與脾細胞的雜交瘤細胞株6C2產生的。?

本發明的第三個目的是提供了單核細胞增生性李氏桿菌的檢測方法，是用純化的重組單核細胞增生性李氏桿菌p60蛋白作為免疫原制備得到上述的雜交瘤細胞株6C2，篩選出能特異性識別單核細胞增生性李氏桿菌p60的上述的單核細胞增生性李氏桿菌p60單克隆抗體，并進行生物素化處理，以A-B?ELISA方法建立定性檢測和定量分析單增李氏桿菌p60的檢測方法。?

進一步的，上述的單核細胞增生性李氏桿菌的檢測方法，包括以下步驟：?

1）p60蛋白的表達及純化：

提取單核細胞增生性李氏桿菌4b的基因組DNA，PCR擴增p60基因，定向克隆入pET-30a表達載體，用IPTG進行誘導表達；