[發(fā)明專利]大腸桿菌O157:H7的LAMP檢測引物及檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410130191.3
• 申請日: 2014-04-02
• 公開（公告）號: CN103866030A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張雪寒;汪偉;何孔旺;倪艷秀;溫立斌;李彬;周俊明;王小敏
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

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一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及檢測大腸桿菌O157:H7的LAMP引物及檢測試劑盒，屬于生物和食品檢測領(lǐng)域。

二、背景技術(shù)

大腸桿菌（Escherichia?coli,?E.coli）O157:H7是重要的食源性病原菌，能夠在全世界范圍內(nèi)引起動物、家禽和人類爆發(fā)感染，不僅關(guān)乎食品安全，而且與醫(yī)療和公共衛(wèi)生問題密切相關(guān)。

現(xiàn)如今，許多報(bào)道嘗試研制更特異的方法檢測E.coli?O157:H7。傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定技術(shù)使用選擇性培養(yǎng)基或者顯色平板檢測E.coli?O157:H7，但是這種方法費(fèi)時，費(fèi)力，準(zhǔn)確性差。?PCR技術(shù)和定量PCR檢測技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用各檢測領(lǐng)域，發(fā)揮著不可忽視的作用，但對儀器設(shè)備等要求較高，不適合快速和臨床樣品的檢測。我們前期研究工作中，通過對已有E.coli?O157:H7全基因組序列生物信息學(xué)，比對分析，發(fā)現(xiàn)新的閱讀框編碼鞭毛類基因，它唯一的存在于E.coli?O157:H7基因組中，為適應(yīng)更廣泛領(lǐng)域檢測的需要，有必要建立新型的檢測技術(shù)。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是由日本學(xué)者T.Notomi發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)依賴于4條特異設(shè)計(jì)的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可以高效、高特異性地?cái)U(kuò)增靶序列。近年來，國內(nèi)外已經(jīng)將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原檢測，如LAMP可以檢測多種病原菌，例如沙門氏桿菌、李氏桿菌、大腸桿菌等。目前未見能夠特異性和專一性檢測大腸桿菌O157:H7?LAMP的報(bào)道。

本發(fā)明的大腸桿菌O157:H7?LAMP檢測技術(shù)避免了現(xiàn)有檢測手段存在的某些問題，相比較其他檢測手段，建立的大腸桿菌O157:H7?LAMP方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測周期短、操作簡單方便的特點(diǎn)。

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三、發(fā)現(xiàn)內(nèi)容

技術(shù)問題??本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性檢測大腸桿菌O157:H7?LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明的試劑盒使用方便，結(jié)果鑒定直觀，檢測敏感性和特異性高，并且易于大范圍推廣使用。

技術(shù)方案??

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

本發(fā)明設(shè)計(jì)一種大腸桿菌O157:H7?LAMP檢測試劑盒，該試劑盒包括以下4條引物，所述引物序列分別如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示。

所述試劑盒包括反應(yīng)液A和SYBR?Green?I，所述反應(yīng)液A具體包括：每23?uL的反應(yīng)體系包括10×ThermoPol?Reaction?Buffer（美國NEB公司）2.5?uL、2.5mM?dNTPs?2?uL、1M?的Mg₂SO₄?4?uL、8U/?uL?Bst?DNA酶（美國NEB公司）?1?uL、超純水12.5?uL，以及如下的引物：

5?μM堿基序列如SEQ?ID?NO.1?和SEQ?ID?NO.2所示的引物各0.25?uL，50?μM堿基序列如SEQ?ID?NO.3?和SEQ?ID?NO.4所示的引物各0.25?uL。

本發(fā)明還涉及一種利用所述大腸桿菌O157:H7?LAMP檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

（1）待檢模板的制備：

糞便或者食物10克，加入到90mL磷酸鹽緩沖液中，37℃震蕩2h后，取1mL加入到9mL心腦浸出液培養(yǎng)基中；如果待檢樣品為液體，則直接取1mL加入到9mL心腦浸出液培養(yǎng)基中；培養(yǎng)基中再加入100?uL?濃度為50mg/mL新生霉素，37℃繼續(xù)培養(yǎng)18h，吸取1mL培養(yǎng)物，500?r離心15min，棄沉淀，吸取上清至新離心管，12000r離心10min，棄上清，取沉淀重懸于1/10體積雙蒸水中，沸水浴10min，4℃12000轉(zhuǎn)離心10min，吸取上清，即待檢模板DNA。

（2）取2?uL提取的待檢模板加入到所述的反應(yīng)液A中，終體積為25?uL，混勻，置于64℃恒溫50?min進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；

（3）結(jié)果判定：取出上述擴(kuò)增反應(yīng)管，在其中加入1?uL20×SYBR?Green?I，如反應(yīng)管中液體變?yōu)榫G色，則說明樣品中含有大腸桿菌O157:H7；如果顏色為橘黃色，則說明樣品中不含有大腸桿菌O157:H7。

有益效果??

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：?