[發(fā)明專利]EHD2抗體及其在制備乳腺癌免疫組化檢測(cè)試劑中的應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410125627.X
• 申請(qǐng)日: 2014-03-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103923212A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 應(yīng)國(guó)光;劉博
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津市應(yīng)世博科技發(fā)展有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;C12Q1/68;G01N33/68;G01N33/574;C07K14/47
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是EHD2的表達(dá)與亞細(xì)胞定位與乳腺癌患者的生存具有顯著相關(guān)性，可以作為乳腺癌惡性度診斷和預(yù)后預(yù)判的一個(gè)分子指標(biāo)。

背景技術(shù)

乳腺癌是女性常見(jiàn)惡性腫瘤。全世界每年有一百萬(wàn)婦女患病，自20世紀(jì)70年代末開(kāi)始、我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率一直居女性腫瘤的首位。北美、北歐原是乳腺癌的高發(fā)區(qū)，現(xiàn)在我國(guó)的發(fā)病率也從五年前的十萬(wàn)分之十七增加到去年的十萬(wàn)分之五十二，呈快速上升趨勢(shì)，而且發(fā)病年齡也越來(lái)越年輕化，年齡最小的只有十四歲。引發(fā)乳腺癌的因素是多方面的，除遺傳因素外還有環(huán)境因素、精神因素及工作壓力太大等因素。而且經(jīng)濟(jì)越發(fā)達(dá)的城市發(fā)病率越高于農(nóng)村。目前世界各國(guó)投入較大的精力和物力來(lái)研究該病的發(fā)生、發(fā)展，以便采取積極的預(yù)防措施。

目前在臨床上對(duì)腫瘤的惡性度判別主要還是基于在組織病理水平對(duì)腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察，它對(duì)癌細(xì)胞的分化程度和侵犯特性有較強(qiáng)的辨別能力，準(zhǔn)確率可達(dá)50%-75%。然而，這種基于形態(tài)學(xué)的解讀一方面受病理醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)等人為因素影響，另一方面缺乏更深層次的與病人個(gè)體發(fā)病因素相關(guān)的分子依據(jù)，因此亟需與現(xiàn)代分子技術(shù)相結(jié)合，才能提高判斷的準(zhǔn)確性和特異性，特別是為個(gè)體化治療路徑與方案的選擇提供理論依據(jù)。

雖然腫瘤的發(fā)生與多種因素相關(guān)，但最終的根源主要來(lái)自于基因水平的異常變化，包括基因的擴(kuò)增、突變、缺失、異位等等，導(dǎo)致維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)所需的多個(gè)功能蛋白在表達(dá)水平的高低、生化活性的強(qiáng)弱、甚至亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分布等方面產(chǎn)生變化，當(dāng)這種變化賦予了細(xì)胞無(wú)限增殖能力及轉(zhuǎn)移能力，并不能被體內(nèi)外保護(hù)機(jī)制逆轉(zhuǎn)或殺滅時(shí)，便產(chǎn)生了腫瘤。因此，對(duì)腫瘤惡性本質(zhì)的深刻認(rèn)識(shí)和有效控制的前提是明確這些功能蛋白分子的異變情況，這需要借助免疫組織化學(xué)的手段。

免疫組織化學(xué)技術(shù)應(yīng)用免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)基本原理，通過(guò)抗體對(duì)體內(nèi)蛋白質(zhì)分子抗原的特異性識(shí)別，以及化學(xué)標(biāo)記(熒光素、酶、金屬離子、同位素等)的第二抗體的顯色等作用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)抗原(多肽和蛋白質(zhì))的表達(dá)量及其亞細(xì)胞定位。近年來(lái)，隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的成功研發(fā)，更主要的是對(duì)腫瘤分子機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入，免疫組化在腫瘤診斷與鑒別中的應(yīng)用價(jià)值受到了普遍的認(rèn)可。比如雌激素受體ER、孕激素受體PR和表皮生長(zhǎng)因子受體家族的Her2已經(jīng)被廣泛用于乳腺癌的臨床分子病理診斷，它對(duì)乳腺癌的病理分類和臨床用藥起到了積極的指導(dǎo)作用。這些成果離不開(kāi)腫瘤基礎(chǔ)研究的進(jìn)步，并期待新的分子指標(biāo)被進(jìn)一步揭示和納入臨床應(yīng)用，不斷提高腫瘤診治水平。EHD2基因及其編碼蛋白即可能是這種新的分子指標(biāo)。

EHD2(Epsin?homology(EH)-domain-containing?proteins)屬于EHD蛋白的一種，是一類新型膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控蛋白，含有高度保守的EH結(jié)構(gòu)域，此EH結(jié)構(gòu)域是一個(gè)含有約一百個(gè)氨基酸殘基的片段，早先發(fā)現(xiàn)于EGFR的激酶底物Eps15(Epdemal?Growth?Factor?Receptor?Pathway?Substrate?Clone15)。EHD2參與胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的各步調(diào)控，包括內(nèi)轉(zhuǎn)及前、后內(nèi)含體的過(guò)渡和調(diào)控循環(huán)通路；膜及膜蛋白的各路調(diào)節(jié)，包括消化降解及循環(huán)再生。是整個(gè)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的必不可少的重要環(huán)節(jié)，對(duì)在各種細(xì)胞活動(dòng)中維護(hù)物料傳輸信號(hào)傳導(dǎo)的動(dòng)態(tài)平衡起著關(guān)鍵的作用，它的失調(diào)將導(dǎo)致信號(hào)應(yīng)答失當(dāng)，細(xì)胞功能紊亂，并可能進(jìn)而引發(fā)疾病。

中國(guó)文獻(xiàn)“EHD2干擾影響永生化乳腺上皮細(xì)胞的增殖和遷移”（王洪玉等，中國(guó)腫瘤臨床，2011年第38卷第11期，）公開(kāi)了在乳腺腫瘤中EHD2的基因表達(dá)失調(diào)下降，提示該基因可能是一個(gè)新的乳腺抑癌基因。然而在進(jìn)一步免疫組化研究中我們發(fā)現(xiàn)，雖然EHD2在總體表達(dá)量上呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但這種趨勢(shì)主要在核中；相反，細(xì)胞漿中的表達(dá)卻有升高的趨勢(shì)。而且，EHD2在核中的表達(dá)水平與患者的生存情況密切相關(guān)。因此對(duì)EHD2進(jìn)行免疫組化檢測(cè)將更客觀準(zhǔn)確地反映腫瘤的異化本質(zhì)和患者個(gè)體的臨床預(yù)后情況。

現(xiàn)有的商業(yè)化EHD2抗體有十余種，由主流抗體試劑公司Santa?Cruz和Abcam等提供，但是均屬于基礎(chǔ)研究用試劑，沒(méi)有依據(jù)表明這些抗體可以和我們的抗體一樣具有合格的特異性并可用于免疫組化檢測(cè)，特別是目前尚沒(méi)有任何其它EHD2抗體經(jīng)過(guò)大量組織標(biāo)本的免疫組化驗(yàn)證并顯示出可以通過(guò)對(duì)EHD2的亞細(xì)胞異常定位檢測(cè)來(lái)達(dá)到對(duì)腫瘤的惡性度及患者生存情況進(jìn)行預(yù)后預(yù)判的目的。與本專利申請(qǐng)抗體相比它們有如下缺陷：