[發(fā)明專利]一種順鉑耐藥骨肉瘤U2OS細(xì)胞系及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410123113.0
• 申請(qǐng)日: 2014-03-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103898057B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-02-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟祥寧;關(guān)榮偉;劉鵬;蔡夢(mèng)迪;高巍;宋盈;馬金法;冀國(guó)華;王旭;董科顯;龐博;劉暢
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司11139
• 代理人: 孫皓晨,費(fèi)碧華

1.一種順鉑耐藥骨肉瘤U2OS細(xì)胞系，其特征在于，所述順鉑耐藥骨肉瘤U2OS細(xì)胞系為U2OS/CDP3×10^-8M、U2OS/CDP10^-7M、U2OS/CDP3×10^-7M、U2OS/CDP10^-6M，其微生物保藏號(hào)分別為CGMCC?No.8004、CGMCC?No.8005、CGMCC?No.8006、CGMCC?No.8007，另外，不耐藥的U2OS敏感細(xì)胞系微生物保藏號(hào)為CGMCC?No.8008，保藏日期均為2013年7月18日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

2.制備如權(quán)利要求1所述的順鉑耐藥骨肉瘤U2OS細(xì)胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）細(xì)胞培養(yǎng)

以人骨肉瘤U2OS細(xì)胞系為研究對(duì)象，細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，在不含青霉素、鏈霉素的環(huán)境下，于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO₂、37℃條件下常規(guī)培養(yǎng)，耐藥細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)5個(gè)月后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指標(biāo)分析；

（2）細(xì)胞耐藥濃度的確定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用0.01M的PBS緩沖液沖洗，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶消化之后進(jìn)行稀釋，計(jì)數(shù)，將稀釋的細(xì)胞懸液以2000細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度種入96孔板中，細(xì)胞貼壁后加入設(shè)置濃度梯度的CDP，此后再培養(yǎng)72h，之后經(jīng)換液，讀數(shù)，計(jì)算后得出細(xì)胞系對(duì)CDP的IC₅₀值，以低于此值8～10倍濃度的CDP對(duì)細(xì)胞進(jìn)行耐藥，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)速度及狀態(tài)，待其生長(zhǎng)穩(wěn)定后進(jìn)行下一數(shù)量級(jí)濃度的耐藥培養(yǎng)；

確定人骨肉瘤U2OS敏感細(xì)胞系對(duì)CDP的耐藥起始濃度為3×10^-8M，以3倍遞增為一個(gè)濃度梯度，確定的耐藥細(xì)胞系為U2OS/CDP3×10^-8M、U2OS/CDP10^-7M、U2OS/CDP3×10^-7M、U2OS/CDP10^-6M；

（3）細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析

U2OS敏感細(xì)胞置顯微鏡下觀察到細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，體積中等，大小均勻，細(xì)胞呈橢圓形或不規(guī)則形，胞質(zhì)較少，細(xì)胞核較大，核仁清晰；U2OS/CDP耐藥細(xì)胞在光鏡下觀察，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，與敏感細(xì)胞比，耐藥細(xì)胞變得更加細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞呈橢圓形、梭形或不規(guī)則形，細(xì)胞核、胞質(zhì)增大，多核仁現(xiàn)象增多，并且隨耐藥濃度增加細(xì)胞內(nèi)空泡量增加，高濃度耐藥細(xì)胞不規(guī)則形狀程度嚴(yán)重，細(xì)胞相互交織形成網(wǎng)狀；

（4）耐藥細(xì)胞系耐藥指數(shù)分析

采用MTT比色法檢測(cè)人骨肉瘤U2OS耐藥細(xì)胞系對(duì)CDP的IC₅₀值；

（5）耐藥細(xì)胞系細(xì)胞中期染色體標(biāo)本制備

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞加入終濃度為0.01μg/mL的秋水仙素，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1-2h，將細(xì)胞用吸管吹打下來(lái)，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中1000r/min離心8min，PBS沖洗兩次，加入37℃預(yù)熱的0.075mol/L的KCL，在37℃水浴中低滲作用11-15min，逐滴加入1mL新鮮固定液進(jìn)行預(yù)固定，其中，新鮮固定液為甲醇與冰醋酸的體積比為3:1，1500r/min離心5min，棄上清加入10mL固定液，輕輕混勻，室溫固定30min，1500r/min離心5min，重復(fù)一次，棄上清，視沉淀細(xì)胞量加入1～1.5mL固定液混勻，將細(xì)胞懸液以30cm高度滴于預(yù)冷的載玻片上，室溫晾干，Giemsa染液染色5min，流水沖洗，晾干，置于顯微鏡下觀察；

（6）耐藥細(xì)胞系增殖能力的變化

選取生長(zhǎng)至70%～80%的U2OS敏感細(xì)胞及耐藥細(xì)胞系細(xì)胞，每種細(xì)胞分別接種到7塊96孔板中，每種細(xì)胞設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，在每個(gè)孔中加入相應(yīng)細(xì)胞所需的不含藥物的培養(yǎng)基，在接種后的第1天，用MTT法計(jì)算第一塊板子的每種細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目，第2天計(jì)算第二塊板子中的各種細(xì)胞數(shù)目，以此類推直至完成每種細(xì)胞的7天生長(zhǎng)情況檢測(cè)，繪制成圖，即為敏感及各個(gè)耐藥水平細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；

（7）Real-time?PCR檢測(cè)可能參與U2OS對(duì)順鉑耐藥基因的表達(dá)情況

①細(xì)胞總RNA的提取

采用TRIzol?Reagent總RNA提取試劑，按說(shuō)明書(shū)提供方法分別提取U2OS敏感及耐藥細(xì)胞系的總RNA，分別取上述幾種細(xì)胞，用濃度為0.01M的PBS沖洗3次，加入適量TRIzol?Reagent，室溫放置5min裂解細(xì)胞，吹打均勻后以1mL/管分裝至1.5mL?Eppendorf管中。每管加入0.2mL氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置2～3min，4℃、12000r/min離心15min，將上層水相移至干凈Eppendorf管中，加入0.5mL異丙醇，輕輕混勻，室溫放置10min，4℃、7500r/min離心10min。棄上清，75%乙醇洗滌RNA沉淀，7500r/min離心5min，室溫干燥RNA沉淀，5～10min后溶于適量DEPC水。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA樣本的完整性，應(yīng)用Bio-Photometer對(duì)提取的RNA進(jìn)行定量測(cè)定；

②RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA

利用Transcriptor?Eirst?strand?cDNA?Synthesis?Kit（Roche）試劑盒將提取的細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；

③Real-time?PCR

應(yīng)用Primer3.0software設(shè)計(jì)并合成基因特異性引物，將qPCR反應(yīng)體系加入96孔板中，在Roche?LightCycler480型熒光定量PCR儀SYBR?Green?I/HRM?Dye(465-510)系統(tǒng)下運(yùn)行，每一樣本測(cè)量3次，94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共45個(gè)循環(huán)；基因擴(kuò)增水平以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行比較，計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。