[發明專利]重組桿狀病毒及其應用

有效

• 申請號: 201410122911.1
• 申請日: 2014-03-28
• 公開（公告）號: CN104073471B
• 公開（公告）日: 2018-07-20
• 發明（設計）人: 坂東孝彥;菅井睦美
• 申請（專利權）人: 希森美康株式會社
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N5/10;C12R1/93
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 李英

本發明提供整合了編碼γ?谷氨酰羧化酶（GGCX）的基因及編碼DT?黃遞酶（NQO1）的基因的重組桿狀病毒。

技術領域

本發明涉及重組桿狀病毒及含所述病毒的重組型維生素K依賴性蛋白質的制造用試劑盒。另外，本發明也涉及感染了重組桿狀病毒的宿主細胞。再者，本發明也涉及重組型維生素K依賴性蛋白質的制造方法。

背景技術

維生素K是擔負各種維生素K依賴性蛋白質的翻譯后修飾的γ-谷氨酰羧化酶（GGCX）的輔因子。在維生素K的存在下，GGCX將各種維生素K依賴性蛋白質的指定的谷氨酸殘基羧基化，轉變為γ-羧基谷氨酸（Gla）。已知此γ-谷氨酰羧基化對于維生素K依賴性蛋白質的生物學功能（例如，血液凝固、骨代謝、信號傳遞等）極其重要。例如，作為維生素K依賴性蛋白質之一的血液凝固第II因子（凝血酶原）或第X因子通過γ-谷氨酰羧基化，能夠向作為凝固反應的場所的細胞膜的磷脂結合，由此可接受由于其他因子開始的活化反應。

第II因子或如第X因子這樣的維生素K依賴性凝血因子主要用人或牛的血漿作為原料進行制備，由此存在混入感染性物質或制品的批間有差異的問題。因此，近年研究－開發了通過利用哺乳動物細胞的基因重組技術制造維生素K依賴性凝血因子的方法。

但是，已知通過利用哺乳動物細胞的表達系統得到的維生素K依賴性凝血因子完全不被γ-谷氨酰羧基化。由于活化不被γ-谷氨酰羧基化的凝血因子通常是困難的，因此從產業上利用的觀點來看，期望重組維生素K依賴性凝血因子在用表達蛋白質的系統得到的階段就被充分地γ-谷氨酰羧基化。因此開發了，在利用哺乳動物細胞的表達系統中，通過共表達維生素K依賴性蛋白質和GGCX來得到γ-谷氨酰羧基化蛋白質的方法（參照WO2005/038019）。

另一方面，在維生素K依賴性蛋白質的γ-谷氨酰羧基化中，除了GGCX之外，已知維生素K環氧化物還原酶（VKOR）和DT-黃遞酶（NAD（P）H依賴性醌氧化物還原酶1；也被稱為NOQ1）也相關（參見Tie J-K.等人，Blood.vol.117，p.2967-2974（2011））。其中，與γ-谷氨酰羧基化直接相關的酶是GGCX，VKOR及NQO1是與維生素K的再循環相關的酶，近年也開發了在利用哺乳動物細胞的表達系統中，通過共表達維生素K依賴性蛋白質、GGCX及VKOR來得到γ-谷氨酰羧基化蛋白質的方法（參照WO2006/067116）。

發明概述

由于上述的方法均使用利用哺乳動物細胞的表達系統，γ-谷氨酰羧基化蛋白質的產量從工業規模的制造的觀點來看極其少，另外還有制造成本高的問題。

另一方面已知用利用大腸桿菌的表達系統，可期待大量表達期望的蛋白質，但是所表達的蛋白質并未進行翻譯后修飾。此外還知道，在使其表達結構復雜的蛋白質時，所述蛋白質幾乎全部變成不溶性凝集體。另外，用以往的利用鱗翅目昆蟲的表達系統可期待表達接近天然型蛋白質的翻譯后修飾的蛋白質，但在本發明人的預備實驗中，在蠶中表達的維生素K依賴性蛋白質幾乎未被γ-谷氨酰羧基化。

鑒于上述這樣的情況，本發明人以提供制造滿足下述兩個條件的重組型維生素K依賴性蛋白質的手段作為課題：可簡便并且大量地制造維生素K依賴性蛋白質、和所得到的維生素K依賴性蛋白質被充分地γ-谷氨酰羧基化。

本發明人發現，使用整合有編碼GGCX的基因及編碼NQO1的基因的重組桿狀病毒、和整合有編碼維生素K依賴性蛋白質的基因的重組桿狀病毒的鱗翅目昆蟲的表達系統，可簡便并且大量地得到維生素K依賴性蛋白質，所得到的維生素K依賴性蛋白質被充分地γ-谷氨酰羧基化，從而完成本發明。

本發明提供整合了編碼γ-谷氨酰羧化酶（GGCX）的基因及編碼DT-黃遞酶（NQO1）的基因的重組桿狀病毒。

本發明提供重組型維生素K依賴性蛋白質的制造方法。此方法包括下述步驟：使用整合有編碼GGCX的基因及編碼NQO1的基因的重組桿狀病毒，在鱗翅目昆蟲或上述鱗翅目昆蟲的培養細胞中表達γ-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質。