[發明專利]蛋白酶3抗體(PR3-Ab)定量測定試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201410122408.6
• 申請日: 2014-03-30
• 公開（公告）號: CN104090111A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發明（設計）人: 于大為;楊曉勇
• 申請（專利權）人: 北京中航賽維生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531;G01N33/532
• 代理公司: 北京富天文博興知識產權代理事務所(普通合伙) 11272
• 代理人: 劉壽椿

1.一種蛋白酶3抗體(PR3-Ab)定量測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括磁分離試劑、酶標記試劑、校準品、清洗濃縮液、底物溶液以及穩定劑。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述磁分離試劑的制備步驟如下：

一、配制磁微粒緩沖液，以配制1L為例：?

1）、量取800mL純化水于容器中，稱取Tris?12.1g和NaCl?8.5g加入容器中，充分攪拌至完全溶解；?

2）、稱取BSA?5g，量取新生牛血清50mL，Proclin300?0.2m至容器中，充分攪拌至完全溶解；?

3）、調pH，控制在pH在7.9-8.1之間；?

4）、最后用純化水定容至1L，用0.2um濾器過濾，2-8℃保存待用；

二、制備磁分離試劑：

1）、取100mg含羧基（COOH）活性基團的磁微粒，用0.025mol/L，pH4.5-5?MES緩沖液10mL混懸；

2）、加入0.5-1mL濃度為10mg/mL的EDC水溶液，室溫混懸30-60min；

3）、磁分離，去上清，用0.025mol/L，pH4.5-5?MES緩沖液10mL重懸；

4）、加入0.02-0.1mg的PR3抗原，室溫混懸120-240min；

5）、磁分離，去上清，用磁微粒緩沖液重懸到1mg/mL，完成磁分離試劑的制備。

3.如權利要求1-2任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述酶標記試劑的制備步驟如下：

一、配制酶標記試劑稀釋液，以配制1L為例：

1）、量取800mL純化水于容器中，稱取Hepes?6.06g、NaCl?8.5g加入容器中，充分攪拌至完全溶解；?

2）、稱取BSA?5g，Zncl_2?0.1g、Proclin-300?0.2mL和MgCl_2?0.1g于容器中中，充分攪拌至完全溶解；?

3）、調pH，控制pH在7.5-8.0之間；?

4）、最后用純化水定容至1L，2-8℃保存待用；

二、堿性磷酸酶（ALP）與PR3抗體的偶聯

1）、取1mg?PR3抗體，加入10mg/mL的偶聯劑2-IT溶液2-4μL，室溫靜置20min，加入0.1moL/L的甘氨酸溶液10μL，室溫靜置5min；用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后的PR3抗體，2-8℃保存備用；

2）、取1.5mg的ALP，加入5mg/mL的SMCC溶液10-20μL，室溫靜置30min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后的ALP，2-8℃保存備用；

3）、將上述活化的PR3抗體與活化的ALP混合，2-8℃條件下靜置12-24h，用Supperdex200凝膠純化柱純化偶聯物，獲得PR3抗體-ALP連接物濃溶液，?2-8℃保存備用；

4）、將PR3抗體-ALP連接物濃溶液用酶標記物稀釋液稀釋到0.02-0.1μg/mL，完成酶標記試劑的制備。

4.如權利要求1-3任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述校準品的制備步驟如下：

一、校準品稀釋液的配制：

1）、量取600mL純化水于容器中，稱取200mL新生牛血清加入容器中，充分攪拌混合均勻；?

2）、稱取磷酸氫二鉀3.4g、磷酸二氫鉀0.36g、Proclin300?0.02?mL加入容器中，充分攪拌至完全溶解；?

3）、調pH，控制pH在7.0-7.5之間；?

4）、最后用純化水定容至1L，2-8℃保存待用；

二、校準品的配制：用校準品稀釋液將PR3抗體分別配制為0、5、20、50、150、300U/mL共6個濃度點。

5.如權利要求1-4任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述清洗濃縮液的配置步驟如下：以配制1L為例：?

1）、量取800mL純化水于容器中，稱取Tris?12.1g和NaCl?8.5g于容器中，充分攪拌至完全溶解；

2）、稱取Tween-20?5g?、Triton?X-100?5g，充分攪拌，直至完全混勻；

3）、調pH，控制pH在7.5-8.0之間；?

4）、最后定容1000mL，2-8℃保存。