[發(fā)明專利]無乳鏈球菌BibA重組蛋白及其編碼基因、制備方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410121035.0
• 申請日: 2014-03-28
• 公開（公告）號: CN103910786A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發(fā)明（設計）人: 王旭榮;李建喜;楊志強;王學智;常瑞祥;王磊;張景艷;秦哲;孔曉軍;孟嘉仁
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所
• 主分類號: C07K14/315
• 分類號: C07K14/315;C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;A61K39/09;A61P31/04;C12R1/19
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 張秋云

技術領域

本發(fā)明涉及生物工程領域中的無乳鏈球菌BibA重組蛋白及其編碼基因、制備方法和應用。?

背景技術

無乳鏈球菌是一種人畜共患病原菌，可感染人、奶牛、兔、羅非魚、牛蛙等多種脊椎動物，人體醫(yī)學上將無乳鏈球菌稱為B群鏈球菌（GBS）。GBS能使帶菌孕婦引發(fā)早產、晚期流產、胎兒發(fā)育不良、胎膜早破、子宮內膜炎、泌尿道感染等；無乳鏈球菌在奶牛上可引起奶牛的急性、亞急性和慢性乳房炎。?

目前無乳鏈球菌可分為10個血清型，臨床研究表明，該菌存在耐藥性逐年增強的趨勢，所以疫苗預防該病成為科研工作者的首要目標。但目前研制無乳鏈球菌常規(guī)疫苗存在許多技術難點：1）無乳鏈球菌菌體滅活疫苗免疫保護效果有差異?；2）血清型眾多，不同血清型菌株之間交叉保護性差；3）目前已知的保護性抗原較少。因此，篩選和獲得無乳鏈球菌的候選免疫蛋白成為研制奶牛乳房炎高效疫苗的關鍵技術問題。目前尚無關于無乳鏈球菌BibA蛋白用于疫苗候選蛋白的報道。?

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術中的缺陷，提供了可作為無乳鏈球菌基因工程疫苗候選蛋白的無乳鏈球菌BibA重組蛋白。?

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為：無乳鏈球菌BibA重組蛋白，具有如序列2所示的蛋白序列。?

本發(fā)明的第二個目的是提供了上述無乳鏈球菌BibA重組蛋白的編碼基因。?

進一步的，上述的無乳鏈球菌BibA重組蛋白的編碼基因，是如下a）或b）的基因：?

a）其核苷酸序列是序列表中的序列1；

b）在嚴格條件下與a）限定的DNA序列雜交且編碼所述無乳鏈球菌BibA重組蛋白的DNA分子。

本發(fā)明的第三個目的，是提供了含有上述無乳鏈球菌BibA重組蛋白的編碼基因的重組表達質粒，所述重組表達質粒為pCold^TMⅠDNA-BibA。?

本發(fā)明的第四個目的，是提供了含有上述重組表達質粒的工程菌，所述工程菌為pCold^TMⅠ-BibA/BL21(DE3)。?

上述一種無乳鏈球菌BibA重組蛋白的制備方法，包括有以下步驟：?

1）獲得如上所述的無乳鏈球菌BibA重組蛋白的編碼基因；

2）將步驟1）得到的無乳鏈球菌BibA重組蛋白克隆入表達載體pCold^TMⅠDNA中，得到pCold^TMⅠ-BibA重組質粒；

3）將步驟2）得到的pCold^TMⅠ-BibA重組質粒導入宿主細胞E.?coli?BL21-DE3；

4）誘導表達得到無乳鏈球菌BibA重組蛋白。

本發(fā)明的第五個目的，是提供了上述無乳鏈球菌BibA重組蛋白作為基因工程疫苗研制過程中的候選蛋白的應用。?

具體操作步驟為：

（1）設計引物：

設計的BibA基因的表達引物對為：

上游引物BibA1：?5'-CGCGGATCCTCGGATTCAATTCCTCAT-3'（斜體下劃線為BamHⅠ酶切位點），

下游引物BibA2：?5'-CGGAATTCTGCATAATATCCAGGTGTAGGC-3'（斜體下劃線為EcoRⅠ酶切位點)；

（2）BibA基因的擴增與獲得：

以提取的無乳鏈球菌基因組DNA為模板進行BibA基因的PCR擴增，反應體系為50.0μL：DNA模板6.0μL，上下游引物各1.0μL?，Premix?Ex?Taq?25.0μL，ddH₂O?17.0μL；PCR反應條件為：95℃預變性5?min、95℃變性1?min、64℃復性1?min、72℃延伸1?min，反應30個循環(huán)；72℃延伸10?min；