[發(fā)明專利]一種斑鳩霉素的生物合成基因簇及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410120626.6
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN104073507A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張長生;張光濤;張文軍;張慶波;朱義廣;張海波;李蘇梅;馬亮
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院南海海洋研究所
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N9/88;C12N1/20;C12P17/18;C12R1/465
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種斑鳩霉素的生物合成基因簇及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

斑鳩霉素（Ikarugamycin）屬于多環(huán)tetramate大環(huán)內(nèi)酰胺類化合物，其結(jié)構(gòu)式如圖1的式1所示，其具有獨特5-6-5三環(huán)系統(tǒng)以及抗菌及抗腫瘤細胞等多種生物活性。目前斑鳩霉素已作為抗腫瘤先導(dǎo)化合物引起關(guān)注，相應(yīng)的具體藥理機制正在深入研究中。

近年來蓬勃發(fā)展起來的組合生物合成技術(shù)，為改造斑鳩霉素的生產(chǎn)菌Streptomyces?sp.ZJ306帶來了新的機遇。在闡明了自然界的生物合成途徑、理解自然界聚酮化合物天然組合生物合成機理的基礎(chǔ)上，人們可以采用組合生物合成技術(shù)對抗生素的生物合成基因、調(diào)控基因進行體內(nèi)敲除、突變、置換和重組等操作，不但能夠生產(chǎn)“非天然”的天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物，而且還可以提高天然產(chǎn)物的產(chǎn)量，或定向積累所需要的天然產(chǎn)物，為天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和藥物開發(fā)提供化合物結(jié)構(gòu)和生物活性多樣化。

迄今為止，有關(guān)珠江口源微生物中斑鳩霉素生物合成基因簇、類Michael環(huán)化反應(yīng)酶等生物催化制備斑鳩霉素及基因敲除獲得斑鳩霉素類似物等，國內(nèi)外尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種斑鳩霉素的生物合成基因簇。

本發(fā)明是以珠江口沉積物源放線菌Streptomyces?sp.ZJ306中斑鳩霉素為目標(biāo)分子，在篩選到生物合成基因簇基礎(chǔ)上，綜合運用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、合成生物學(xué)、生物化學(xué)及有機化學(xué)相結(jié)合的技術(shù)，闡明了斑鳩霉素的生物合成機制，為利用組合生物合成方法修飾改造斑鳩霉素類似物提供依據(jù)，為藥物篩選提供化合物實體。

本發(fā)明的斑鳩霉素生物合成基因簇來源于珠江口沉積物放線菌Streptomyces?sp.ZJ306，其特征在于，該生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1的第3411-15678位的堿基序列所示，包括3個基因，具體為：

（1）負責(zé)斑鳩霉素的聚酮-鳥氨酸-聚酮骨架合成的基因，即ikaA，位于核苷酸序列（SEQ?ID?NO.1，下同）第3411-12785個堿基處，長度為9375個堿基對，編碼雜合的聚酮/非核糖體聚肽合成酶，3124個氨基酸；

（2）負責(zé)斑鳩霉素骨架合成修飾的另一個基因，即ikaB，位于核苷酸序列第12782-14614個堿基處，長度為1833個堿基對，編碼FAD依賴的氧化還原酶，610個氨基酸；

（3）負責(zé)斑鳩霉素的還原型環(huán)化反應(yīng)的基因，即ikaC，位于核苷酸序列第14614-15678個堿基處，長度1065個堿基對，編碼乙醇脫氫酶，354個氨基酸。

SEQ?ID?NO.1（序列表）所示序列的第3411-15678位堿基序列的互補序列可根據(jù)DNA堿基互補原則隨時得到，且第3411-15678位堿基序列或部分核苷酸序列可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）或用合適的限制性內(nèi)切酶酶切相應(yīng)DNA或DNA重組技術(shù)獲得。

本發(fā)明提供了構(gòu)建至少包含部分SEQ?ID?NO.1所示序列的第3411-15678位中DNA片段的重組DNA載體途徑。

本發(fā)明還提供了創(chuàng)制斑鳩霉素生物合成基因被阻斷或異源表達等其他基因改造的途徑，至少其中之一的基因包含SEQ?ID?NO.1所示序列的第3411-15678位中DNA片段。

本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可使用PCR探針法或Southern雜交等技術(shù)，從其他生物體重篩選獲得斑鳩霉素的生物合成基因簇同源基因。

本發(fā)明提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可用于Streptomyces?sp.ZJ306基因組文庫中定位更多的文庫質(zhì)粒。這些文庫質(zhì)粒至少包括本發(fā)明中的部分序列，也包含Streptomyces?sp.ZJ306基因組中鄰近區(qū)域未克隆DNA。

包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的DNA片段，可以被體內(nèi)外突變等修飾，包括插入、置換、缺失、易錯聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、位點特異性突變、不同序列重組、定向進化等。

包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆，可以通過合適表達系統(tǒng)在外源宿主中表達生產(chǎn)相應(yīng)酶或者提高生物活性化合物產(chǎn)量。這些外源宿主包括大腸桿菌、鏈霉菌、假單胞菌、芽孢桿菌、酵母及動植物等。

本發(fā)明提供的氨基酸序列可以用于分離所需蛋白并可用于抗體制備。