[發明專利]酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢桿菌的定量分析方法

有效

• 申請號: 201410120323.4
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN103993071A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 許正宏;史勁松;陸震鳴;肖辰;黃志勇;王松濤;鄧波;代宇;曾娜;劉世龍
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所;江南大學;瀘州品創科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 成都虹橋專利事務所(普通合伙) 51124
• 代理人: 梁鑫

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢桿菌的定量分析方法。

背景技術

我國白酒的生產歷史悠久，但眾多白酒生產廠家的發酵過程都以傳統的經驗為主，工藝可控性較差，并且產品品質存在批次差異，尤其是風味差異較大。這主要是由于釀造過程中微生物復雜多樣，對白酒發酵過程中的微生物作用機制不清楚。中國白酒的釀造工藝是多菌種混合發酵工藝，通過多種微生物的代謝作用產生不同風味的白酒。白酒的生產中有三個主要的發酵階段：主發酵期、生酸期以及產香味期。在主發酵期，淀粉質原料如糯米、高粱等經過微生物的一系列代謝作用，最終生成酒精的階段；在生酸期，窖內的酒醅經過復雜的生物化學等變化，產生大量的有機酸，其中細菌代謝活動酸類物質生成的主要途徑；產香味期，在該階段發酵前期產生的乙醇和酸類物質，經微生物產生的酶的催化作用形成大量酯類物質和其他的香味物質。因此，發酵過程酒醅微生物群落結構和數量是影響白酒風味物質形成的重要因素。

研究者采用傳統培養、現代分子生物學技術等方法，對酒醅中微生物群落結構進行分析和研究，發現乳酸菌、梭菌、芽孢桿菌是酒醅微生物菌群中的主要功能菌，但這3類微生物在發酵過程中的動態變化情況不清楚，因此闡明發酵過程中乳酸菌、梭菌、芽孢桿菌生物量的動態變化，對闡明白酒動態發酵過程以及白酒風味物質的形成都具有重要的意義。

通過傳統培養與現代分子生物學技術，對酒醅中微生物群落結構進行分析和研究，了解了酒醅中主要微生物群落結構的組成，但是，酒醅主要的微生物定量檢測缺乏一種合理、快捷的方法，傳統對酒醅中微生物定量檢測的方法，仍然采用選擇培養基的篩選和純培養分離計數的方法，但是，該方法受到外界環境因素，菌種特性等影響，檢測結果缺乏穩定性和可靠性，且耗時費力。

熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。該技術不僅實現了DNA模板的定量，而且具有特異性強、靈敏度高、高通量、反應全封閉、定量準確、速度快及自動化程度高等特點，已成為在分子生物學及微生物領域中重要的定量方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種分子生物技術用于定量檢測酒醅發酵過程中乳酸菌、梭菌、芽孢桿菌生物量的動態變化，以指導實踐。

本發明的技術方案是酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢桿菌的定量分析方法，包括如下步驟：

a、標準曲線的制備：設計針對梭菌、乳酸菌和芽孢桿菌的標準細菌的特異性引物，然后進行熒光定量PCR，根據拷貝數與CT值構建的標準曲線；

b、提取基因組DNA：利用洗脫、酶消化結合的方法提取提取酒醅微生物群落的宏基因組；

c、擴增：采用梭菌、乳酸菌和芽孢桿菌的特異性引物，對酒醅微生物宏基因組中梭菌、乳酸菌和芽孢桿菌的特異性片段進行擴增；

d、定量分析：通過標準曲線和待測樣品的CT值對窖泥微生物群落中梭菌、乳酸菌和芽孢桿菌進行定量分析。

具體的，步驟a和c中擴增乳酸菌的特異性引物如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。

具體的，步驟a和c中擴增梭菌的特異性引物如SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示。

具體的，步驟a和c中擴增芽孢桿菌的特異性引物如SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.6所示。

乳酸菌特異性引物序列（5′→3′）：

Lacto-F：AGAACACCAGTGGCGAAGG（SEQ?ID?No.1）；

Lacto-R：CAGGCGGAGTGCTTAATGC（SEQ?ID?No.2）。

梭菌特異性引物序列（5′→3′）：

Clost-F：AAAGGRAGATTAATACCGCATAA（SEQ?ID?No.3）；

Clost-R：TTCTTCCTAATCTCTACGCA（SEQ?ID?No.4）。

芽孢桿菌特異性引物序列（5′→3′）：

Bacil-F：ATGGCTGTCGTCAGCT（SEQ?ID?No.5）；

Bacil-R：ACGGGCGGTGTGTAC（SEQ?ID?No.6）。

上述引物中的R為A或G。