[發明專利]一株殼聚糖酶產生菌及其應用

在審

• 申請號: 201410120173.7
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN103966119A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 邱樂泉;吳石金;鐘衛鴻;鐘莉
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P19/14;C12P19/04;C12P19/12;C12R1/01
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術領域

本發明涉及一株殼聚糖酶產生菌——Mitsuaria sp.GD02-M41，及其在微生物酶解殼聚糖制備殼寡糖中的應用。

（二）背景技術

殼聚糖（Chitosan）為幾丁質脫乙酰化后的產物，溶解性能較幾丁質有很大提高，具有良好生物相容性。殼寡糖（Chito-oligosaccharide)一般是指2～10個聚合度的低糖，可通過殼聚糖水解制得，具有較低的分子量，呈水溶性，非常容易被人體吸收，作為一種功能性低聚糖，具有抗細菌、抗真菌、抗腫瘤、調節人體免疫及抗癌等功效，在醫藥、食品等領域中具有廣泛的應用前景。

目前制備殼寡糖的方法主要有化學降解法和酶解法，采用化學法降解寡糖得率低，產物分離困難，而且對環境污染嚴重。酶解法則具有反應條件溫和，寡糖得率高，不造成環境污染等優點。殼聚糖水解酶主要有殼聚糖酶、N-乙酰葡萄糖胺酶以及非專一性水解酶等。殼聚糖酶是殼聚糖的專一性水解酶，能特異性將殼聚糖水解成聚合度為2～8的殼寡糖，是制備殼寡糖的主要研究方向。

殼聚糖具有廣譜抗菌性，而且對人體無毒無副作用，不同分子量的殼聚糖的抗菌性能有所差異。如管云林等采用Staphylococcus aureus作為試驗菌株，發現隨殼聚糖的分子量降低抗菌性能增強，并由此提出了殼聚糖抗菌的兩個模型。夏文水等采用Escherichia coli作為試驗菌株，發現隨分子量上升抑制菌效果逐漸下降，而且通過試驗測定分子量為1500的殼寡糖抑菌效果最強。Keisuke U等報道平均分子量小于5000的殼聚糖對Staphylococcus aureus和Escherichia coli不僅沒有抗菌作用，反而能促進細菌的生長，而分子量約9300的殼聚糖幾乎可以完全抑制細菌生長。Yousook等報道分子量為4萬的殼聚糖在濃度為0.5%時，對Staphylococcus aureus和Escherichia coli的殺滅率為90%，分子量為18萬的殼聚糖在濃度為500ppm時，對Staphylococcus aureus和Escherichia coli的殺菌率幾乎為100%。楊玉紅曾報道相對分子質量分別為500、2100、3700、5200、9000的殼寡糖對Escherichia coli的抑制作用，發現相對分子質量2100的殼寡糖對大腸桿菌抗菌作用最強，其抑菌作用隨殼寡糖質量濃度的增加而增強。

（三）發明內容

發明目的是提供經篩選誘變獲得的一株殼聚糖酶產生菌——Mitsuaria sp.GD02-M41，及其在微生物酶解殼聚糖制備殼寡糖中的應用。

本發明采用的技術方案是：

一株殼聚糖酶產生菌——Mitsuaria sp.GD02-M41，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學，郵政編碼：430072，保藏日期：2014年3月19日，保藏編號：CCTCC No：M2014095。

本發明篩選到一株產殼聚糖酶菌株，對該菌株進行紫外誘變育種，經補料發酵培養，殼聚糖酶產量最大達4.86U/ml，并研究了采用該菌株產生的殼聚糖酶制備殼寡糖的可能性，測定了殼聚糖不同酶解時間產物的平均聚合度和分子量，考察了殼寡糖對大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的抗菌性能，為專一性酶促生產殼寡糖打下基礎。

本發明還涉及所述的Mitsuaria sp.GD02-M41在微生物酶解殼聚糖制備殼寡糖中的應用。

本發明的有益效果主要體現在：本發明經篩選誘變獲得的一株殼聚糖酶產生菌——Mitsuaria sp.GD02-M41產生的殼聚糖酶為內切酶，酶解殼聚糖后不產生氨基葡萄糖，相比于化學水解方式，能在更短時間內獲得殼寡糖，且無污染、條件溫和，具有良好的應用前景。

（四）附圖說明

圖1為Mitsuaria sp.GD02的系統發育樹；

圖2為水解時間對殼寡糖完全水解的影響；

圖3為發酵時間對殼寡糖完全水解的影響；

圖4為HCl濃度對殼寡糖完全水解的影響；

圖5為TLC薄層層析；1，7：氨基葡萄糖標準品；2：酶解5min；3：酶解10min；4：酶解20min；5：酶解30min；6：酶解60min；

圖6為殼聚糖/殼寡糖對大腸桿菌生長的影響；

圖7為殼聚糖/殼寡糖對酵母菌生長的影響；