[發(fā)明專利]博來霉素抗性報告基因突變體及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410119211.7
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN103981175A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李凱;徐惠芬;張安迪;張佳
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/70;C12N15/85;C12N1/21;C12N5/10;C12Q1/68;C12Q1/34;C12Q1/04;C12N15/10
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 范晴

1.博來霉素抗性報告基因突變體，其中，在博來霉素基因的起始密碼子ATG和其后的第一個氨基酸密碼子GCC之間插入一定長度的異源靶序列核苷酸片段。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的博來霉素抗性報告基因突變體，其中，所述一定長度的異源核苷酸片段是指大于等于1bp堿基并小于1kb堿基的非3整數(shù)倍的或大于等于1bp堿基并小于1kb堿基的3的整數(shù)倍且含終止密碼子異源靶序列核苷酸片段；

或者，所述一定長度的異源核苷酸片段是指大于等于1bp堿基且小于1kb堿基的3的整數(shù)倍的異源靶序列核苷酸片段。

3.權(quán)利要求1所述的博來霉素抗性報告基因突變體，其中，所述異源靶序列核苷酸片段為核酸酶靶序列。

4.一種載體，其含有權(quán)利要求1-3任一項的博來霉素抗性報告基因突變體，

所述載體為質(zhì)粒。

5.一種細胞，其含有權(quán)利要求1-3任一項的博來霉素抗性報告基因突變體或權(quán)利要求4所述的載體，其中，所述細胞為大腸桿菌或哺乳動物細胞。

6.權(quán)利要求1-3任一項所述博來霉素抗性報告基因突變體或權(quán)利要求4所述載體用于核酸酶活性和脫靶效應(yīng)的檢測。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中，博來霉素抗性報告基因突變體插入大于等于1bp堿基并小于1kb堿基的非3整數(shù)倍的或大于等于1bp堿基并小于1kb堿基的3的整數(shù)倍且含終止密碼子的異源靶序列核苷酸片段，導致其閱讀框架改變，博來霉素抗性消失；

或者，博來霉素抗性報告基因突變體插入大于等于1bp堿基且小于1kb堿基的3整數(shù)倍的異源靶序列核苷酸片段，不導致其閱讀框架改變與閱讀框架的提前終止，博來霉素抗性不消失。

8.權(quán)利要求1-3任一項所述博來霉素抗性報告基因突變體或權(quán)利要求4所述載體用于剪輯后的原核或真核細胞株系的陽性篩選。

9.制備權(quán)利要求1-3任一項所述博來霉素抗性報告基因突變體的方法，其包

括如下步驟：

(1)擴增或者合成得到起始密碼子ATG后含有限制性內(nèi)切酶位點的博來霉素抗性報告基因片段，

(2)將上述步驟得到的博來霉素抗性報告基因片段插入到具有至少另一種抗性報告基因的質(zhì)粒中，

(3)將步驟（2）中得到的質(zhì)粒酶切，在博來霉素基因的起始密碼子ATG和其后的第一個氨基酸密碼子GCC之間插入待檢測的異源靶序列核苷酸片段。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其中，所述步驟（1）中以具有博來霉素抗性報告基因的質(zhì)粒為模版擴增；

所述步驟（3）中，所述異源靶序列核苷酸片段為合成的核酸酶靶序列，且核酸酶靶序列粘性末端為:5’NNNNNNNGCCAA3’；和3’NNTACNNNNNNN5’。