[發明專利]一種檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙及其制備方法

無效

• 申請號: 201410119000.3
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN103901200A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 馬嵐;莫笑晗;吳峰;夏振遠;袁航;譚仲夏;秦西云;晉艷
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農業科學研究院;清華大學深圳研究生院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 昆明知道專利事務所(特殊普通合伙企業) 53116
• 代理人: 姜開俠

1.一種檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，該試紙包括含有煙草花葉病毒標記抗體的磁性樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和背板，所述磁性樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊從上到下依次固定在背板上，其特征在于，所述硝酸纖維素膜上設置有相互分離的檢測區和質控區，所述檢測區含有煙草花葉病毒包被抗體，所述質控區含有能與所述煙草花葉病毒標記抗體特異結合的抗抗體。

2.根據權利要求1所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，其特征在于，所述煙草花葉病毒標記抗體為煙草花葉病毒抗體和超順磁性復合粒子以肽鍵共價結合形成的聚合體。

3.根據權利要求2所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，其特征在于，所述超順磁性復合粒子為粒徑為100nm、磁飽和強度為40?emu/g，對應的外磁場響應速度為20秒、表面羧基含量為80?μmol/g的超順磁性Fe₃O₄納米粒子。

4.根據權利要求2所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，其特征在于，所述煙草花葉病毒抗體的親和常數為10⁸?M^-1。

5.根據權利要求1、2、3、4任一權利要求所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，其特征在于，所述煙草花葉病毒標記抗體為煙草花葉病毒單克隆抗體。

6.根據權利要求1所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，其特征在于，所述煙草花葉病毒包被抗體為煙草花葉病毒單克隆抗體；所述抗抗體為羊抗鼠IgG抗體。

7.根據權利要求6所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，其特征在于，所述煙草花葉病毒包被抗體的濃度為2?mg?/ml，所述羊抗鼠IgG抗體的濃度為1?mg?/ml。

8.根據權利要求1所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，其特征在于，所述磁性樣品墊采用玻璃纖維膜制作。

9.一種制備如權利要求1、2、3、4、6、7、8中任一權利要求所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙的方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、制備煙草花葉病毒標記抗體：

1）將2.5mg超順磁性復合粒子、0.96mg的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）、1.15mg的N-羥基丁二酰亞胺（NHS）和1ml?0.1M?MES緩沖液（pH=4.7）混勻，在37?oC溫度條件下反應0.5h，得到活化后磁性粒子；?

2）?將步驟1中得到的活化后磁性粒子、0.15mg煙草花葉病毒抗體和0.8ml濃度為50mM，pH為8.5的硼砂緩沖液混勻，在37oC溫度條件下反應3.5h，得到含有偶聯后磁性粒子的反應液；

3）將步驟2中得到的反應液中加入濃度為5%的BSA混勻，在37?oC溫度條件下反應0.5h，得到含有封閉后磁性粒子的反應液；

4）將步驟3中得到的反應液中的封閉后磁性粒子用0.02M?PBS緩沖液（pH=7.4）進行洗滌、懸浮，得到煙草花葉病毒標記抗體，4?oC保存待用；

B、制備設置有檢測區和質控區的硝酸纖維素膜：

將所述煙草花葉病毒包被抗體和抗抗體分別噴涂在硝酸纖維素膜的兩端不同區域，形成檢測區和質控區，得到含有檢測區和質控區的硝酸纖維素膜，然后放入干燥室中干燥；

C、制備含有煙草花葉病毒標記抗體的磁性樣品墊：

將步驟A中制得的煙草花葉病毒標記抗體用緩沖液稀釋50倍,得到煙草花葉病毒標記抗體溶液；將玻璃纖維膜在溫度為37℃的緩沖液中浸泡1小時；用上述煙草花葉病毒標記抗體溶液噴涂上述玻璃纖維膜，得到磁性樣品墊，然后放入干燥室中干燥；

D、將所述磁性樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊從上到下依次固定在背板上，裁切得到檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，然后將試紙與干燥劑一起放入鋁箔袋密封包裝，4℃貯存。

10.根據權利要求9所述的制備檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙的方法，其特征在于，所述步驟C中使用的緩沖液由2ml?TritonX100、10g?BSA、50g蔗糖和950ml濃度為0.02M、pH為7.4的PBS緩沖液混合得到，調節pH至7.4，并定容到1000ml。