[發(fā)明專利]印度塊菌SSR引物及其跨種篩選方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410118959.5
• 申請(qǐng)日: 2014-03-27
• 公開（公告）號(hào): CN103849689A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 喬鵬;劉培貴;田偉;陳娟;萬(wàn)山平;趙文青
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 昆明協(xié)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 53108
• 代理人: 馬曉青

1.印度塊菌SSR引物，其核苷酸序列如下：

2.如權(quán)利要求1所述的印度塊菌SSR引物，它包括10對(duì)引物，其核苷酸序列特征如下表所示：

3.如權(quán)利要求1所述的印度塊菌SSR引物是基于近緣種全基因組序列開發(fā)的。

4.權(quán)利要求1所述的印度塊菌SSR引物在塊菌遺傳多樣性分析中的應(yīng)用。

5.權(quán)利要求1所述的印度塊菌SSR引物在DNA指紋圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用。

6.權(quán)利要求1所述的印度塊菌SSR引物在建立印度塊菌種質(zhì)資源庫(kù)中的應(yīng)用。

7.權(quán)利要求1所述的印度塊菌SSR引物在定位功能基因中的應(yīng)用。

8.利用權(quán)利要求1所述的印度塊菌SSR引物進(jìn)行塊菌遺傳多樣性分析的方法，其特征是所述方法包括下述步驟：

（1）DNA提取，

利用改良的4×CTAB法提取樣品總DNA；

（2）引物擴(kuò)增及電泳檢測(cè)，

以步驟（1）提取的DNA為模板，利用如權(quán)力要求1所示的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將步驟（2）的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，之后采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染顯色；并對(duì)結(jié)果進(jìn)行多態(tài)性統(tǒng)計(jì)分析和遺傳多樣性分析；

（3）建立供試材料SSR基因型信息數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行遺傳多樣性分析，所述遺傳多樣性分析為：用Popgene32軟件計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)觀察到的等位基因數(shù)目（Na），觀測(cè)雜合度（Ho），期望雜合度（He）；哈迪—溫伯格平衡（Hardy-Weinberg?equilibrium,HWE）在Genepop?Web?Version3.4（http://genepop.curtin.edu.au/）中進(jìn)行檢測(cè)，用FSTAT?V.2.9.3進(jìn)行連鎖不平衡檢測(cè)，利用NTSYS-pc?V2.10e軟件計(jì)算品種間的遺傳相似系數(shù)，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，繪制樹狀圖。

9.如權(quán)利要求8所述的印度塊菌遺傳多樣性分析的方法，其特征是，所述步驟（2）PCR反應(yīng)體系（25μl）為：30ng?DNA樣品，1×PCR緩沖溶液，2.0mMMgCl₂，0.2mM?dNTP，0.2μM引物，1.0U?TaqDNA聚合酶；PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2.5min，隨后94℃30s，45℃～58℃（依引物的退火溫度而定）30s，72℃30s，循環(huán)35～40次，在72℃延伸20min，最后4℃保存。

10.如權(quán)利要求8所述的印度塊菌遺傳多樣性分析的方法，其特征是，包括下述步驟（1）提取樣品DNA；（2）以步驟（1）提取的DNA為模板，利用表中成對(duì)引物分別PCR擴(kuò)增，得PCR產(chǎn)物；（3）將步驟（2）制得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行多態(tài)性統(tǒng)計(jì)分析和遺傳多樣性分析；

所述步驟（1）提取樣品DNA步驟如下：

①選取適量的硅膠干燥材料放入研缽中，加入少量石英砂和PVP，加入液氮，用研杵研磨，直至材料呈粉末狀；

②將研磨好的材料轉(zhuǎn)移入1.5ml離心管中，在離心管中加入去多糖Buffer700μl，利用牙簽使其與材料充分混勻，冰浴30min；

③冰浴后取出離心管，5000r/min離心5min，棄上清，留沉淀；

④再加入65℃預(yù)熱的CTAB溶液500μl，充分混勻，65℃水浴1h，期間不定時(shí)輕搖；

⑤對(duì)于一些在標(biāo)本館保存的較久遠(yuǎn)的材料，可在離心管中加入5M醋酸鉀溶液200μl，冰浴20min；冰浴后取出離心管，加入500μl的V：V=24：1的氯仿-異戊醇，輕搖2-3min，10000r/min離心10min，取上清；

⑥再次在離心管中加入V：V=24：1的氯仿-異戊醇，加滿離心管，輕搖2-3min，10000r/min離心10min，取上清；

⑦加入2/3體積的無(wú)水乙醇（-20℃預(yù)冷），輕搖，放于冰箱-20℃沉降4h至過夜；

⑧從冰箱中取出離心管，10000r/min離心10min，棄上清；-20℃預(yù)冷的75%乙醇10000r/min離心2min洗兩次，-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇洗一次，每次洗滌離心13000r/min離心2min；

⑨將離心管倒扣于通風(fēng)櫥內(nèi)，風(fēng)干2小時(shí)，使乙醇揮發(fā)，干燥后，加入50μlTE溶液或無(wú)菌水，搖床內(nèi)36℃，保溫30min，不搖晃，使DNA溶解；

⑩檢測(cè)DNA的純度與濃度：所得總DNA首先用1%的瓊脂糖凝膠電泳，據(jù)DNA主帶的整齊度和亮度初步判斷DNA的質(zhì)量；繼而用紫外分光光度計(jì)ND-1000,Thermo?Fisher?Scientific,Delaware,USA）測(cè)定DNA的濃度和純度，而后用ddH₂O稀釋至30-50ng/μL；

所述步驟（2）的PCR反應(yīng)體系為：30ng?DNA樣品，1×PCR緩沖溶液，2.0mM?MgCl₂，0.2mM?dNTP，0.2μM引物，1.0U?TaqDNA聚合酶，加水至25μl；

所述步驟（2）的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2.5min，隨后94℃30s，45℃～58℃30s，72℃30s，循環(huán)35～40次，最后在72℃延伸20min，最后4℃保存；

印度塊菌SSR引物包括10對(duì)引物，其核苷酸序列特征如下表所示：

所述步驟（2）的各引物反應(yīng)體系和條件如下表所示：

所述步驟（3）的瓊脂糖凝膠電泳為1％的瓊脂糖凝膠電泳；

所述步驟（3）的8%聚丙烯酰胺凝膠電泳為：順序安裝聚丙烯酰胺凝膠電泳儀各部件，灌膠并凝聚2小時(shí)，在電壓105V，電流43mA條件下電泳3.5個(gè)小時(shí)，取下凝膠，做好標(biāo)記，進(jìn)行以下步驟：

①在固定液360ml水，40ml乙醇，2ml乙酸中固定10min，后水洗1次；

②在銀染液400ml水，4ml20%AgNO₃中銀染3-10min，后水洗1次；

③在脫色液400ml水，80ul10%Na₂S₂O₃中脫色15-60s，后水洗2次；

④在顯影液360ml水，40ml15%NaOH，甲醛1ml中顯影10min。