[發明專利]一種檢測犬貓弓形蟲抗體的間接ELISA試劑盒

無效

• 申請號: 201410118911.4
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN103837688A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 劉全;王澤東;蔡玉峰;魏峰
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明公開了一種犬貓弓形蟲抗體檢測的間接ELISA試劑盒，屬于基因工程技術和診斷試劑領域。?

背景技術

弓形蟲病是弓形蟲引起的一種重要人獸共患寄生蟲病，導致人及動物流產、畸胎、死胎，嚴重危害公共衛生安全和畜牧業生產。貓是弓形蟲終末宿主，犬是弓形蟲中間宿主，在弓形蟲的傳播與感染中起重要作用。目前弓形蟲尚無有效疫苗，犬貓弓形蟲感染的監測對于疾病的防控具有重要意義。?

弓形蟲感染的診斷主要包括病原學、分子生物學及免疫學等方法。病原學方法費時、費力、敏感性低。分子生物學方法包括PCR、DNA探針及基因芯片等技術具有較高的敏感性和特異性，但需要昂貴的儀器設備，操作過程較復雜。免疫學檢測方法包括染色試驗(DT)、間接熒光抗體試驗(IFAT)、間接血凝試驗(IHA)、直接凝集試驗(DAT)、改良凝集實驗（MAT）、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，其中DT需要用活的蟲體，存在生物安全風險；IFAT具有較高的敏感性和特異性，但需要專門的儀器設備，不適合臨床使用；IHA和LAT無種屬特異性，但其敏感性較低；MAT檢測結果被認為是金標準，但對犬弓形蟲檢測出率較低。ELISA敏感性、特異性較高，適合于大樣本量檢測。?

目前弓形蟲ELISA檢測所用的抗原多是蟲體可溶性抗原，其成分不確定，抗原制備批次間差別較大，不易標準化。隨著分子生物學技術不斷發展，重組抗原作為弓形蟲的診斷抗原具有無可比擬的優勢，如抗原成分確定，易標準化，特異性強等。弓形蟲速殖子有3種分泌細胞器，微線體、棒狀體和致密顆粒。致密顆粒蛋白(dense?granule?protein,?GRA)主要是在蟲體修飾納蟲泡時及細胞內存活中起重要作用，與蟲體在細胞內存活和復制有相關，能夠引發宿主T細胞B細胞強烈的免疫應答，其中GRA7分泌過程持續速殖子感染宿主的整個階段，是排泄分泌（ES）抗原的主要成分，能夠刺激干擾素及腫瘤壞死因子的大量分泌，具有良好的免疫原性，是一種潛在的疫苗、診斷侯選抗原分子。本發明公開了以重組GRA7作為犬貓弓形蟲抗體檢測的間接ELISA試劑盒，與其它方法相比，具有較強的敏感性和特異性。?

發明內容

本發明提供了一種以重組蛋白GRA7為抗原來檢測犬貓弓形蟲抗體的間接ELISA試劑盒，其目的在于克服現有技術存在的特異性不強、假陽性率高等缺點和不足，用于弓形蟲抗體的定性檢測。?

本發明提供的犬貓弓形蟲抗體的間接ELISA試劑盒包括重組抗原GRA7預包被酶標板、樣品稀釋液、陽性對照、陰性對照、酶結合物、洗滌液、底物顯色液和終止液。?

本發明所述的試劑盒制備方法包括以下步驟：?

1、弓形蟲重組GRA7蛋白的表達與純化：運用PCR技術擴增弓形蟲GRA7基因，將其克隆入原核表達載體pET-28a(+)，構建重組質粒pET-GRA7，經酶切鑒定分析和序列測定。將重組質粒pET-GRA7轉化大腸桿菌BL21，IPTG誘導后，表達產物進行SDS-PAGE分析，在約29kDa處出現特異性表達帶，與預期一致。重組菌裂解后，9000?rpm離心6?min，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE，結果顯示目的蛋白主要以不可溶性形式表達（圖1）。Western?blotting分析，表達產物能與弓形蟲陽性血清反應（圖2）。重組蛋白經Ni-NTA純化后，純度達90%以上（圖3）。

2、抗原包被：將純化的重組蛋白GRA7用pH?9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至5μg/mL，包被96孔酶標板，每孔50μL，4℃過夜，用洗滌液洗5遍，每遍5min；加入5%脫脂奶粉配制成的封閉液，每孔100μL，溫箱37℃，1h；隨后用洗滌液洗滌5遍，每遍5min，4℃保存備用。?

3、兔抗犬或貓IgG的制備和辣根過氧化物（HRP）標記：按常規方法提取純化犬或貓IgG，免疫家兔，當兔抗血清ELISA效價達1:32以上時取血清；硫酸銨沉淀純化；用改良的過碘酸氧化法進行標記；最后酶標記物加入5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白和50%的中性甘油，測定工作濃度后，-20℃保存備用。?