[發明專利]一種基于不對稱膜的人體黑素細胞的培養方法

有效

• 申請號: 201410118279.3
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN103908701B
• 公開（公告）日: 2017-03-08
• 發明（設計）人: 許愛娥;王文俊;鄒潔輝;蔣森陽;尉曉冬
• 申請（專利權）人: 杭州市第三人民醫院;浙江大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61L27/38;A61L27/24;A61L27/22;A61L27/20;A61L27/18;A61L27/60
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司33200
• 代理人: 周烽

技術領域

本發明屬生物醫學領域，尤其涉及一種基于不對稱的生物膜材料的黑素細胞培養方法。

發明背景

白癜風是一種常見的皮膚色素脫失性皮疾病，在人群中發病率達0.5-2%，病因是人體皮膚中黑素細胞的功能喪失。白癜風表現為局部或泛發型白斑，白斑處因缺乏黑色素，容易被陽光灼傷甚至引發癌變，同時也會給患者帶來社交憂慮引起心理疾病。

目前治療白癜風主要有三類療法：藥物療法、光化學療法、外科手術療法。藥物療法和光化學療法療效一般且副作用大，因此人們更多的關注外科手術療法。外科手術療法利用組織工程技術，將人體黑素細胞體外培養，培養一段時間后轉移至患處，達到治療疾病的效果。常用的黑素細胞懸液移植療法，因其流動性強在關節處治愈率低。構建生物相容性支架，將黑素細胞培養在支架上形成細胞皮片達到培養和轉移一體化，能有效改善懸液移植療法的不足之處。

利用組織工程技術、通過細胞負載與轉移，為治療白癜風提供新的途徑。CN?102648987A公開了一種將透明質酸鈉-殼聚糖類復合材料制備成具有光滑面和海綿面的不對稱面材料，促進上皮細胞、內皮細胞生長，但該材料未用于黑素細胞的培養。CN?1785444A公開了一種膠原-殼聚糖和硅橡膠雙層皮膚再生支架材料，能誘導缺損處細胞遷移、增殖和分化，但該材料不支持黑素細胞、成纖維細胞的生長。CN?1422668A公開了一種醫用微孔殼聚糖不對稱膜材料，能防止術后傷口粘連，但僅僅起到傷口敷料作用。CN?103007364公開了一種脂肪族聚酯雙層不對稱引導組織再生膜材料，其制備過程存在有機溶劑的殘留。現有不對稱膜的相關公開專利主要用于傷口敷料，未涉及在黑素細胞培養中的應用。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種基于不對稱的生物膜材料的黑素細胞的培養方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種基于不對稱膜材料的黑素細胞的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）制備不對稱的生物膜材料：將一種或兩種生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后，配成質量濃度為1-10%的水溶液；將水溶液注入細胞培養板，鼓風條件下于30-70oC下烘0.1-5小時，使溶液表面水分揮發，形成1-10微米的致密膜；然后加入氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液，浸泡24小時，使致密膜下層溶液發生相分離，形成多孔結構，所述氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液中，氫氧化鈉和碳酸鈉的總質量與水的質量配比為1-10:90-99混合組成，且氫氧化鈉與碳酸鈉的質量配比為1:3-3:1；用去離子水清洗至溶液pH為中性，-60~-40oC冷凍干燥8-24小時，得到不對稱膜；然后用交聯劑對不對稱膜在20-50oC交聯處理0.5-24小時，交聯處理后用純凈水沖洗除凈殘留的交聯劑，再在鼓風條件下于30-120oC下烘2-48小時。

（2）構建細胞-不對稱膜復合材料：不對稱膜用于接種細胞前，用體積濃度為75%的酒精浸泡12小時，隨后再用PBS洗凈殘留酒精，并置于紫外燈下照射3-24小時。完成消毒滅菌后，在細胞培養板里注入細胞培養液，置于細胞培養箱中于37oC、體積濃度為5%?的CO₂、飽和濕度條件進行孵化。將按1-40:?0-200:?0-100的細胞個數比例共培養的黑素細胞、成纖維細胞和角質形成細胞以????????????????????????????????????????????????個細胞/cm²的密度接種在孵化過的不對稱膜上，同時加入1-10毫升的細胞培養液，置于細胞培養箱于37oC、體積濃度為5%?的CO₂、飽和濕度條件下培養，每兩天更換一次細胞培養液，培養時間為1-10天，即獲得細胞-不對稱膜的復合材料。

一種基于不對稱膜的黑素細胞的培養方法，包括以下步驟：

（1）制備不對稱的生物膜材料：1:50-50:1的重量比例混合后，配成質量濃度為1-10%的水溶液；將溶液注入細胞培養板，-60-?-40oC冷凍干燥8-24小時，得到多孔支架；再將上述溶液注入細胞培養板，將多孔支架完全鋪展置于溶液上，鼓風條件下于30-70oC烘0.1-5小時，使水分完全揮發，形成不對稱膜；然后用交聯劑對不對稱膜在20-50oC交聯處理0.5-24小時，交聯處理后用純凈水沖洗除凈殘留的交聯劑；然后0.01-0.3摩爾/升的氫氧化鈉、碳酸鈉或重量比例為3:1-1:3的氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液浸泡24小時，用去離子水清洗至溶液pH為中性；再在鼓風條件下于30-120oC下烘2-48小時。