[發明專利]基于多肽的黑色素瘤生物標記物傳感器

無效

• 申請號: 201410117665.0
• 申請日: 2014-03-25
• 公開（公告）號: CN104020293A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 李根喜;殷詠梅;王曉盈;仇金榮
• 申請（專利權）人: 李根喜
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種傳感器，特別是涉及一種基于多肽的黑色素瘤生物標記物傳感器。

背景技術

作為一種極具侵襲力和高死亡率的腫瘤，黑色素瘤的特征主要表現在轉移方式的不可預測性和高度的復發和死亡風險，即使在手術治療后，患者的復發和死亡的風險仍然存在。因此，及時監測腫瘤的進展和復發非常重要。近年來的研究結果表明，S100B(靶蛋白)是一種獨立的黑色素瘤生物標記物，它不僅與腫瘤的分期、疾病的進展和復發密切相關，而且還能提供黑色素瘤患者的預后信息并預測相應的治療效果。基于黑色素瘤生物標記物S100B這些獨特的生物學意義，目前已有相關文獻報道：作為黑色素瘤的生物標記物，S100B明顯優于乳酸脫氫酶LDH，盡管乳酸脫氫酶是目前唯一應用于黑色素瘤臨床實踐的標記物。

檢測黑色素瘤患者外周血S100B的含量是實現上述生物學意義的基礎。目前已有的檢測方法包括酶聯免疫吸附法(ELISA)和免疫發光分析法(LIA)等，這些方法都依賴于高親和力的抗體去識別靶蛋白S100B。依賴抗體識別靶蛋白具有一定的局限性，主要體現在：(1)抗體作為一種蛋白，具有較復雜的化學結構，因而不能通過人工合成實現。(2)抗體的生產需要細胞株或者動物，生產過程復雜且生產周期較長；(3)抗體相對價貴且不穩定。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種基于多肽的黑色素瘤生物標記物傳感器，其具有良好的靈敏性和特異性，并具有簡單低耗等優點。

本發明是通過下述技術方案來解決上述技術問題的：一種基于多肽的黑色素瘤生物標記物傳感器，其特征在于，其通過黑色素瘤生物標記物能以1∶2方式結合兩條特異性肽；在其中一條多肽末端修飾MUA，將其固定在電極表面以識別黑色素瘤生物標記物，而在另一條多肽的末端修飾了GHK用以輸出電化學信號；這兩條肽被分別命名為識別肽和信號肽；在黑色素瘤生物標記物存在的情況下，識別肽能特異性的識別并結合黑色素瘤生物標記物；隨后引入已經與銅離子溫育的信號肽，已固定在電極組裝層面的靶蛋白可以進一步結合引入的信號肽，從而形成一個多肽-蛋白-多肽的復合物；信號肽氨基末端上GHK絡合的銅離子可以輸出相應的電化學信號，該信號與黑色素瘤生物標記物的濃度是成比例的；為了提高本檢測方法的靈敏性，絡合的銅離子作為鄰苯二胺氧化反應的催化劑生成具有電化學活性的產物二氨基吩嗪，形成本發明基于多肽的黑色素瘤生物標記物傳感器。

優選地，所述二氨基吩嗪的量與黑色素瘤生物標記物的量是成比例的。

本發明的積極進步效果在于：S100B的生物識別和信號輸出都通過簡單的多肽實現。目前越來越多的文獻認為多肽具有很多優點，這些優點使得在某些情況下，多肽是一種比抗體更合適的選擇。首先，很多多肽都能與相應的靶蛋白特異性的結合，這種結合具有高度的親和力，因而可以實現對靶蛋白的生物識別；其次，多肽的化學結構簡單明確，因而可以直接人工合成；再次，因為多肽具有簡單的化學結構，因而我們可以根據不同的需要對多肽進行進一步的修飾；最后，通過與某些金屬離子結合，多肽可以作為信號輸出的載體，這與相對傳統的檢測方法的信號輸出方式相比，更加簡單易行。我們在與靶蛋白特異性結合的多肽上修飾了一個GHK，這個基序可以作為銅離子的螯合劑，銅離子具有電化學活性，因而螯合了銅離子的多肽可以將生物識別轉換為電輸出信號。此外，銅離子還能作為鄰苯二胺氧化的催化劑，反應生成同樣具有電化學活性的二氨基吩嗪。建立在催化基礎上的電化學信號放大策略使得本方法的檢測靈敏性明顯提高。

附圖說明

圖1為本發明的原理示意圖。

圖2a為本發明的捕獲肽修飾的電極分別經不同濃度S100B、2.5μM絡合了銅離子的信號肽孵育后得到的SWV信號圖。圖2b為3nM?S100B組和空白對照組分別掃描得到DAP的CV信號曲線。

圖3a為檢測不同濃度S100B得到的DAP的SWV信號圖。圖3b顯示的是SWV的信號峰值與S100B濃度的對數值呈線性相關

圖4為DAP的SWV信號圖用以顯示本方法對S100B、BSA和空白對照的選擇性。

圖5檢測手術前后黑色素瘤患者血樣本得到的DAP的SWV信號圖。

圖6a捕獲肽與3nM?S100B孵育不同時間得到的DAP的SWV信號曲線。圖6b圖顯示的是不同孵育時間得到的信號峰值。

圖7a結合了S100B的電極與絡合了銅離子的信號肽孵育不同時間得到的DAP的SWV信號曲線。余實驗步驟和條件均同圖6a。圖7b圖顯示的是不同孵育時間得到的信號峰值。