[發明專利]一種靶向治療和檢測雙功能的抗腫瘤雙特異性小型化抗體

有效

• 申請號: 201410117420.8
• 申請日: 2014-03-26
• 公開（公告）號: CN103951754A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 顧月清;丁笠
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;G01N33/574;A61K47/42;A61P35/00
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 孫立冰

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種對人類表皮生長因子受體EGFR1和HER2均具有高親和力的小型化融合抗體及其應用，其可用于癌癥診斷和治療。?

背景技術

受體酪氨酸激酶ErbB家族在細胞的生長、增殖和分化等生理過程中起到重要的作用。該受體家族包括四個成員：表皮生長因子受體(EGFR1、ErbB1或HER1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)。該家族成員均由胞外配體結合結構域、胞內激酶結構域以及跨膜結構域組成，與腫瘤細胞的生物學過程具有密切的聯系。?

表皮生長因子(EGF)是EGFR1的天然配體。其與EGFR1結合后，激活了EGFR1的受體酪氨酸激酶活性，進而激活下游一系列信號通路(如PI3K/Akt)，最終對腫瘤細胞的生長、增殖、分化、遷移起到促進作用。HER2無天然配體，但其能與家族其它受體成員發生異二聚化。當EGFR與HER2發生二聚化時，HER2下游通路(RAS/RAF/MAPK、PI3K/Akt、STAT、PLC)也被激活，促進一系列細胞行為。而目前研究表明，HER2高表達的腫瘤通常更具侵襲性，病人也往往預后不良。EGFR1和HER2在多種如乳腺癌、肺腺癌等腫瘤中呈陽性表達，這使它們成為很有前景的腫瘤細胞靶點。并且研究顯示，EGFR1和HER2通常在腫瘤細胞行為中協同發生作用，兩者共同導致細胞的癌變。當ErbB家族其它成員過表達時，單獨靶向于其中單一家族成員的抗腫瘤藥物起不到很好的療效。?

鑒于EGFR1和HER2在腫瘤發生中所扮演的重要角色，大量針對EGFR1和HER2的藥物陸續上市，其主要分為大分子單克隆抗體(如西妥昔、赫賽汀)和小分子酪氨酸激酶抑制劑類藥物(如伊馬替尼、達沙替尼、尼羅替尼和拉帕替尼等)。單克隆抗體類藥物分子量通常在150kD左右，其過大的分子量使其進入腫瘤組織細胞的效率較低，體內代謝時間過長，從而導致了其治療效率較低、體內積蓄毒性較高等缺點；另一方面，目前上市的單克隆抗體都是單一靶向于EGFR1和HER2,由于EGFR1和HER2的協同作用，這些抗體對于EGFR1/HER2雙陽性腫瘤顯示不出很好的療效。而小分子酪氨酸激酶抑制劑類藥物雖然易于進入腫瘤細胞組織，但缺乏腫瘤主動靶向性是其重要缺陷，而且酪氨酸激酶在人體正常的細胞生理活動中也起著重要的作用，該類藥物對非腫瘤部位酪氨酸激酶的無差別抑制也導致了較大的體內毒性；盡管拉帕替尼對于EGFR1和HER2酪氨酸激酶均有較好的抑制效果，但由于靶向特異性缺失所導致的體內毒性也使得該類藥物的研發和使用進入了一個瓶頸階段。?

發明內容

本發明公開了一種雙重靶向EGFR1和HER2的小型化雙特異性抗體，其具有分子量小(只有29kD)且易于進入腫瘤組織、雙靶點特異靶向等優點，對于EGFR/HER2過表達腫瘤的治療具有至關重要的作用。?

體內體外實驗均表明本發明的雙特異性小型化抗體具有低毒性、非腫瘤部位體內清除快速等優點。其在體內體外均能與表達表皮生長因子受體EGFR1和HER2的腫瘤細胞特異性結合，且對EGF和EGFR1的結合具有強烈的拮抗作用，能夠對EGFR1和HER2下游腫瘤增殖、遷移、侵襲相關信號通路進行調控。在艾氏腹水癌小鼠移植瘤治療試驗中，該抗體療效顯著，可用于癌癥診斷和治療。此外，該抗體能夠偶聯抗腫瘤藥物和近紅外熒光染料進行活體腫瘤治療和檢測，具有很高的腫瘤治療和檢測效率。?

最重要的是，無論在體內還是體外，該雙特異性抗體均展現了強于相同摩爾濃度的EGFR1特異性抗體和HER2特異性抗體聯合使用的靶向活性，起到了協同的效果。?

本發明的EGFR1/HER2雙特異性小型化抗體命名為MaAbNA，其能夠對EGFR和HER2高表達腫瘤進行體內體外診斷，并單獨或偶聯傳統化療藥成為一種腫瘤治療藥物。該雙特異性抗體由HER2(編碼氨基酸1-124)和EGFR1(編碼氨基酸140-268)特異性結構域依次串聯而成,由于其不含抗體恒定區，不僅大大降低了該抗體的分子量(僅為29kD)，使其更易進入腫瘤細胞組織中，在體內代謝更快不會在腎臟中長期積蓄導致腎毒性。為避免各分子之間空間結構的相互干擾，在依次相連的分子中間設計了由(G₄S)₃組成的柔性連接肽，見圖1。?

本發明構建的融合蛋白編碼基因全長為804bp，編碼268個氨基酸，融合蛋白分子量為29kD，其氨基酸序列為SEQ?ID?No:1所示序列，其基因編碼序列為SEQ?ID?No:2所示序列。?