[發(fā)明專利]一種產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410117384.5
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN103830722A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柴同杰;劉萌萌
• 申請（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A61K39/08
• 分類號: A61K39/08;A61P31/04;C12N15/70;C12R1/145
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于是將β毒素蛋白與白油佐劑以體積比為1：1的比例進(jìn)行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞制得；所述的β毒素蛋白的制備方法包括以下步驟：

1）菌種復(fù)活及模板制備

用接種環(huán)挑取C型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種接種于一個(gè)血平板培養(yǎng)基上，40℃厭氧（88％N₂、7％H₂、5％CO₂）培養(yǎng)36h；取單個(gè)菌落接種于一個(gè)含7-8毫升硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FT）的試管內(nèi)，37℃厭氧培養(yǎng)12h，取1～5ml的培養(yǎng)液按照DNA提取試劑盒說明提取DNA，作為擴(kuò)增目的基因的模板；

2）β毒素基因的克隆

根據(jù)GenBank中β毒素的基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收擴(kuò)增產(chǎn)物；

Primer1:GGAATTCAATGATATAGGTAAAACTAC;

Primer2:CCTCGAGTTAAATAGCTGTTACTTTGTGAGT

3）構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-β

將目的基因PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28a均使用Eco?RI和Xho?I酶切；將酶切后分別回收的目的基因PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28a進(jìn)行純化；將純化的目的基因PCR產(chǎn)物和載體pET28a進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pET28a-β；將pET28a-β與BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到重組菌株BL21(DE3)-β；

4）β毒素基因的原核表達(dá)、蛋白純化

用0.6mM的IPTG，37℃，對重組菌誘導(dǎo)表達(dá)12h，經(jīng)純化得到β毒素蛋白。

2.一種產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素基因工程疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1）菌種復(fù)活及模板制備

用接種環(huán)挑取B型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種接種于一個(gè)血平板培養(yǎng)基上，40℃厭氧（88％N₂、7％H₂、5％CO₂）培養(yǎng)36h；取單個(gè)菌落接種于一個(gè)含7-8毫升硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FT）的試管內(nèi)，37℃厭氧培養(yǎng)12h，取1～5ml的培養(yǎng)液按照DNA提取試劑盒說明提取DNA，作為擴(kuò)增目的基因的模板；

2）β毒素基因的克隆

根據(jù)GenBank中β毒素的基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收擴(kuò)增產(chǎn)物；

Primer1:GGAATTCAATGATATAGGTAAAACTAC;（SEQ.ID.N02所示）

Primer2:CCTCGAGTTAAATAGCTGTTACTTTGTGAGT（SEQ.ID.N03所示）

3）構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-β

將目的基因PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28a均使用Eco?RI和Xho?I酶切；將酶切后分別回收的目的基因PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28a進(jìn)行純化；將純化的目的基因PCR產(chǎn)物和載體pET28a進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pET28a-β；將pET28a-β與BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到重組菌株BL21(DE3)-β；

4）β毒素基因的原核表達(dá)、蛋白純化

用0.6mM的IPTG，37℃，對重組菌誘導(dǎo)表達(dá)12h，經(jīng)純化得到β毒素蛋白；

5）β毒素基因工程苗制備

將上述步驟中制備好的β毒素蛋白與白油佐劑以體積比為1：1的比例進(jìn)行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到。

3.如權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素基因工程疫苗在預(yù)防因產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素引起的仔豬紅痢中的應(yīng)用。