[發(fā)明專利]SCO6974基因缺失天藍色鏈霉菌及其在提高抗生素產(chǎn)量的應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410116480.8
• 申請日: 2014-03-26
• 公開（公告）號: CN103881951A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設計）人: 劉鋼;李淑賢;俞靈軍
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/76;C12N15/11;C12P17/16;C12P21/04;C12R1/465
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及SCO6974基因缺失天藍色鏈霉菌及其在提高抗生素產(chǎn)量的應用。

背景技術

鏈霉菌（Streptomyces）是一種極具應用價值的微生物。據(jù)目前所知，約三分之二用于醫(yī)藥的天然抗生素以及共9000余種具生物活性物質都由鏈霉菌產(chǎn)生，它們在抗腫瘤、抗真菌、抗寄生蟲、免疫抑制等方面具有重要作用。天藍色鏈霉菌作為鏈霉菌研究的模式菌株，其研究價值及應用價值極高。作為抗生素代謝調控研究的模式菌株，對天藍色鏈霉菌的研究較為深入，它能產(chǎn)生放線紫紅素（ACT）、十一烷基靈菌紅素（RED）、鈣依賴抗生素（CDA）、次甲霉素（Mmy）。ACT屬于聚酮中的苯并異色烷醌（benzoisochromanequinone,BIQ)類的抗生素，具有抗菌活性，在不同pH條件下培養(yǎng)，ACT會顯現(xiàn)出不同的顏色，有助于研究和直接觀察天藍色鏈霉菌次級代謝過程的多效調控。CDA是一種脂肽類的抗生素，具有抗菌活性。

ACT化學結構式如下式1所示：

式1；

CDA的化學結構式如式2所示：

式2。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供SCO6974基因缺失天藍色鏈霉菌及其在提高抗生素產(chǎn)量的應用。

本發(fā)明提供了構建重組菌的方法，包括如下步驟：敲除天藍色鏈霉菌基因組中的SCO6974基因，得到重組菌；

所述SCO6974基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。

上述方法中，所述敲除天藍色鏈霉菌基因組中的SCO6974基因通過同源重組的方法實現(xiàn)。

上述方法中，所述同源重組的方法包括如下步驟：

1）將含有預敲除SCO6974基因的片段導入含有SCO6974基因cosmid的出發(fā)菌中，得到中間菌，提取所述中間菌的質粒，得到SCO6974基因缺失的cosmid；

2）將SCO6974基因缺失的cosmid接合轉移到天藍色鏈霉菌中，得到SCO6974基因缺失的重組菌。

上述方法中，所述出發(fā)菌按照包括如下步驟的方法制備：將含有SCO6974基因的cosmid導入大腸桿菌E.coli?BW25113/pIJ790中，得到出發(fā)菌；

所述SCO6974基因缺失的cosmid通過E.coli?ET12567(pUZ8002)接合轉移到天藍色鏈霉菌中。

上述方法中，所述含有預敲除SCO6974基因的片段的核苷酸序列為序列表中的序列3；

所述天藍色鏈霉菌為天藍色鏈霉菌M145。

由上述方法制備的重組菌也是本發(fā)明保護的范圍。

失活SCO6974基因的物質或上述的重組菌在提高抗生素產(chǎn)量中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。

上述應用中，所述失活SCO6974基因的物質為含有預敲除SCO6974基因的片段，所述片段的核苷酸序列為序列表中的序列3；

所述抗生素具體為放線紫紅素和/或鈣依賴抗生素。

SCO6974基因在調控抗生素產(chǎn)量中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；所述SCO6974基因的核苷酸序列為序列表中的序列1；所述抗生素具體為放線紫紅素和/或鈣依賴抗生素。

上述調控抗生素產(chǎn)量為提高抗生素產(chǎn)量。

本發(fā)明還提供了一種DNA片段，其核苷酸序列為序列表中的序列3。

本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明利用PCR-Targeting技術構建了SCO6974基因敲除工程菌株，檢測其與抗生素產(chǎn)生關系，結果為與未敲除的野生型菌株相比，SCO6974基因敲除工程菌株產(chǎn)生放線紫紅素（ACT）和鈣依賴抗生素（CDA）的量大。說明該基因與抗生素產(chǎn)生有關。

附圖說明

圖1為SCO6974基因敲除工程菌構建簡圖及PCR驗證圖

圖2為SCO6974基因敲除工程菌放線紫紅素（ACT）產(chǎn)量提高效果圖

圖3為SCO6974基因敲除工程菌鈣依賴抗生素（CDA）產(chǎn)量提高效果圖

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中培養(yǎng)基配方如下：

LB培養(yǎng)基配方：

細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)???????10g