[發明專利]SCO6974基因缺失天藍色鏈霉菌及其在提高抗生素產量的應用

有效

• 申請號: 201410116480.8
• 申請日: 2014-03-26
• 公開（公告）號: CN103881951A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 劉鋼;李淑賢;俞靈軍
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/76;C12N15/11;C12P17/16;C12P21/04;C12R1/465
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及SCO6974基因缺失天藍色鏈霉菌及其在提高抗生素產量的應用。

背景技術

鏈霉菌（Streptomyces）是一種極具應用價值的微生物。據目前所知，約三分之二用于醫藥的天然抗生素以及共9000余種具生物活性物質都由鏈霉菌產生，它們在抗腫瘤、抗真菌、抗寄生蟲、免疫抑制等方面具有重要作用。天藍色鏈霉菌作為鏈霉菌研究的模式菌株，其研究價值及應用價值極高。作為抗生素代謝調控研究的模式菌株，對天藍色鏈霉菌的研究較為深入，它能產生放線紫紅素（ACT）、十一烷基靈菌紅素（RED）、鈣依賴抗生素（CDA）、次甲霉素（Mmy）。ACT屬于聚酮中的苯并異色烷醌（benzoisochromanequinone,BIQ)類的抗生素，具有抗菌活性，在不同pH條件下培養，ACT會顯現出不同的顏色，有助于研究和直接觀察天藍色鏈霉菌次級代謝過程的多效調控。CDA是一種脂肽類的抗生素，具有抗菌活性。

ACT化學結構式如下式1所示：

式1；

CDA的化學結構式如式2所示：

式2。

發明內容

本發明的目的是提供SCO6974基因缺失天藍色鏈霉菌及其在提高抗生素產量的應用。

本發明提供了構建重組菌的方法，包括如下步驟：敲除天藍色鏈霉菌基因組中的SCO6974基因，得到重組菌；

所述SCO6974基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。

上述方法中，所述敲除天藍色鏈霉菌基因組中的SCO6974基因通過同源重組的方法實現。

上述方法中，所述同源重組的方法包括如下步驟：

1）將含有預敲除SCO6974基因的片段導入含有SCO6974基因cosmid的出發菌中，得到中間菌，提取所述中間菌的質粒，得到SCO6974基因缺失的cosmid；

2）將SCO6974基因缺失的cosmid接合轉移到天藍色鏈霉菌中，得到SCO6974基因缺失的重組菌。

上述方法中，所述出發菌按照包括如下步驟的方法制備：將含有SCO6974基因的cosmid導入大腸桿菌E.coli?BW25113/pIJ790中，得到出發菌；

所述SCO6974基因缺失的cosmid通過E.coli?ET12567(pUZ8002)接合轉移到天藍色鏈霉菌中。

上述方法中，所述含有預敲除SCO6974基因的片段的核苷酸序列為序列表中的序列3；

所述天藍色鏈霉菌為天藍色鏈霉菌M145。

由上述方法制備的重組菌也是本發明保護的范圍。

失活SCO6974基因的物質或上述的重組菌在提高抗生素產量中的應用也是本發明保護的范圍。

上述應用中，所述失活SCO6974基因的物質為含有預敲除SCO6974基因的片段，所述片段的核苷酸序列為序列表中的序列3；

所述抗生素具體為放線紫紅素和/或鈣依賴抗生素。

SCO6974基因在調控抗生素產量中的應用也是本發明保護的范圍；所述SCO6974基因的核苷酸序列為序列表中的序列1；所述抗生素具體為放線紫紅素和/或鈣依賴抗生素。

上述調控抗生素產量為提高抗生素產量。

本發明還提供了一種DNA片段，其核苷酸序列為序列表中的序列3。

本發明的實驗證明，本發明利用PCR-Targeting技術構建了SCO6974基因敲除工程菌株，檢測其與抗生素產生關系，結果為與未敲除的野生型菌株相比，SCO6974基因敲除工程菌株產生放線紫紅素（ACT）和鈣依賴抗生素（CDA）的量大。說明該基因與抗生素產生有關。

附圖說明

圖1為SCO6974基因敲除工程菌構建簡圖及PCR驗證圖

圖2為SCO6974基因敲除工程菌放線紫紅素（ACT）產量提高效果圖

圖3為SCO6974基因敲除工程菌鈣依賴抗生素（CDA）產量提高效果圖

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

下述實施例中培養基配方如下：

LB培養基配方：

細菌培養用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)???????10g