[發明專利]銀環毒素抗原表位基因及其在基因疫苗及抗原制備中的應用

有效

• 申請號: 201410116200.3
• 申請日: 2014-03-26
• 公開（公告）號: CN103865934B
• 公開（公告）日: 2017-02-22
• 發明（設計）人: 鄭穎;范泉水;崔慶華;張志曉;葉鋒平;郭平;馮子良;周衛國
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍成都軍區疾病預防控制中心
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/79;C12N15/70;C07K14/46;C07K16/18;A61K48/00;A61P39/02
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙)11130
• 代理人: 孟旭,王為

技術領域

本發明涉及一種基因及其疫苗的制備，特別是涉及一種從α、β和κ銀環毒素中的多個抗原表位的人工合成多肽序列、基因及其應用，屬于生物醫學領域。?

技術背景

毒蛇咬傷在亞洲和非洲國家農村地區一直以來是一個非常嚴重的公共衛生問題。蛇毒毒素按其性質可分為神經毒、血循毒、混合毒三大類。針對毒蛇咬傷最有效的治療藥物主要是抗蛇毒血清，但由于蛇毒本身成分復雜，含有數十甚至上百種功能各異的蛋白質，用全毒免疫馬生產的抗蛇毒血清中，不僅含有能中和毒素成分的抗體，同時也含有大量針對蛇毒中其它非毒素成分的抗體，這不僅使得抗血清效價降低，也增加了使用抗血清的不良反應率。蛇毒毒素按其性質可分為神經毒、血循毒、混合毒三大類。蛇毒神經毒素(neurotoxin,N?T)是毒蛇毒液中毒性最大的成分,它能使動物產生遲緩性麻痹和呼吸衰竭,導致動物死亡。蛇毒的神經毒素主要存在于眼鏡蛇科的眼鏡蛇屬，環蛇屬和曼巴屬毒蛇中。金環蛇、銀環蛇、海蛇等主要含神經毒。尖吻蝮蛇、蝰蛇、烙鐵頭蛇、竹葉青等主要含血循毒。中國常見陸生毒蛇中毒性最強的就是含有神經毒的銀環蛇，而銀環蛇毒的主要致死性毒素是α和β銀環毒素，因而通過生物信息學和分子生物學獲得廣譜的、只含有銀環蛇毒中主要毒素成分關鍵抗原位點的新型抗原，對實現銀環蛇傷高危人群的基因免疫或制備新型免疫原以獲得高效、廣譜的新型抗蛇毒抗體提供了一種新的抗原和基因，也為利用基因工程實現抗蛇毒抗體的人源化奠定了基礎。目前抗蛇毒血清的制備主要是采用傳統的蛇毒全毒免疫馬獲得，隨著分子生物學、免疫學和基因工程技術的發展，發展了一些特異性和效價更高的抗蛇毒血清提的新技術和新方法。國際上主要有采用生化和毒素學手段首先分析鑒定出蛇毒中最主要的毒性成分，再利用這些成分的cDNA進行動物免疫。相關報道如下：?

1.Azofeifa-Cordero?G,Arce-Estrada?V,Flores-Díaz?M,et?al.Immunization?with?cDNA?of?a?novel?P-III?type?metalloproteinase?from?the?rattlesnake?Crotalus?durissus?durissus?elicits?antibodies?which?neutralize69%of?the??hemorrhage?induced?by?the?whole?venom[J].Toxicon2008,52:302-308.?

2.Harrison?RA,Moura-Da-Silva?AM,Laing?GD,et?al.Antibody?from?mice?immunized?with?DNA?encoding?the?carboxyldisintegrin?and?cysteine-rich?domain(JD9)of?the?haemorrhagic?metalloprotease,Jararhagin,inhibits?the?main?lethal?component?of?viper?venom[J].Clin.Exp.Immunol.,2000,121:358–363.?

這些新的蛇毒抗血清的制備方法需首先從復雜的蛇毒中分離純化出單一的毒素成分并進行鑒定后方能設計相應引物，再從毒腺中反轉錄出cDNA，而且由于針對的只是蛇毒中的單一一個毒素成分，因此對于含有多種致死性毒素成分的蛇毒往往不能達到良好療效，同時對于不同蛇種的毒素由于存在種間差異，因此不能起到交叉中和作用。?

利用含有多個毒素抗原表位進行基因免疫或新型抗原制備獲得抗毒素血清的研究報道有：英國利物浦大學的Wagstaff教授利用非洲鋸鱗蝰（Echis?ocellatus）cDNA文庫的表達序列標簽數據庫，得到了7個SVMP抗原位點，串聯后人工合成這7個抗原位點序列并免疫小鼠，免疫后的小鼠對多種非洲鋸鱗蝰的SVMP都具有中和作用，并且能夠中和數種其它非洲蝰科蛇毒；發明人小組利用金屬蛋白酶基因數據庫，得到了6個抗原位點，串聯后合成的序列免疫小鼠，能夠使免疫小鼠抵抗致死性尖吻蝮蛇毒的攻擊。除此之外目前未見其它相關報道。相關文獻見下：?

1.Wagstaff?SC，Laing?GD，Theakston?RD，et?al.Bioinformatics?and?multiepitope?DNA?immunization?to?design?rational?snake?antivenom[J].PLoS?Med，2006，3(6):e184.?