[發明專利]一種綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測定方法

有效

• 申請號: 201410116124.6
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN103884665B
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發明（設計）人: 周洪旭;譚秀梅;許秀蘋;王霞
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及植物保護領域，尤其涉及一種綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測定方法。

背景技術

綠盲蝽是棉田的一種間歇性害蟲，主要以刺吸式口器刺吸為害植物柔嫩組織，形成孔洞，造成“破葉瘋”。隨著轉基因抗蟲棉的大面積推廣種植，以及棉田用藥量的減少，導致轉基因棉田的“非靶標害蟲”-綠盲蝽大爆發，并且，逐漸從棉田繼續向其他寄主遷移，威脅到了葡萄、蘋果樹、桃樹、櫻桃、梨樹等果樹的生長，成為多種植物的新蟲害。

綠盲蝽不同于蚜蟲、粉虱等汁液取食者，它主要取食植物細胞的細胞質和細胞核，屬于細胞取食者。取食時，先將口針插入植物細胞內或細胞間，然后通過口針的劇烈活動撕碎植物細胞同時分泌唾液，將要取食的食物變成泥漿狀，再進行吸食。昆蟲的唾液成分是昆蟲與植物相互關系中起聯系作用的紐帶，因為昆蟲取食植物過程中，除咬食或刺探所造成的損傷外，唾液是昆蟲對植物施加影響的主要因素。植食性昆蟲唾液中含有的酶類和各種有機成分，能誘導植物的一系列生化反應。研究綠盲蝽的唾液消化酶種類并測定其含量，可以一定程度揭示綠盲蝽刺吸危害爆發成災的原因，為綠盲蝽的持續控制提供科學依據。

綠盲蝽相較于蚜蟲或者煙粉虱個體較大，活動能力較強，簡單易操作的唾液酶體外提取方法較少。目前，綠盲蝽唾液酶體外提取方式一般為切頭處理，加入乙酸-乙酸鈉緩沖液在研缽內對其進行低溫研磨，離心機低溫離心，取上清以待測定其唾液酶種類及含量。該方法操作相對繁瑣，需要的蟲量較大，對環境條件要求嚴格，條件不易控制，操作不當對于結果有較大影響。

鑒于上述缺陷，本發明創作者經過長時間的研究和實踐終于獲得了本 創作。

發明內容

本發明的目的在于提供一種綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測定方法，用以克服上述技術缺陷。

為實現上述目的，本發明提供一種綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測定方法，該具體過程為：

步驟a，提取綠盲蝽唾液酶；

取3齡綠盲蝽10頭，饑餓6h后，置于兩端開口的膠卷盒內，頂端覆以兩層Paraflim膜，并在兩膜間的間隙內用移液槍加入100μL液體營養介質，底端覆以紗布保持通氣，重復10次；

將裝置放入光照培養箱中，待綠盲蝽刺吸取食6h后，移走綠盲蝽，用移液槍收集其唾液混合物，放入1.5mL離心管中，同時，設不加綠盲蝽的對照；

步驟b，測定綠盲蝽唾液酶中果膠酶活性；

步驟b1，制作1mg/mL D-半乳糖醛酸標準曲線；

配制1mg/mL D-半乳糖醛酸的溶液，取10支離心管編號，并按下表1加入各種試劑，在沸水浴中加熱5min，冷卻后，在分光光度計540nm處以①號試管為標準空白樣測定其它試管內溶液的OD值，利用回歸分析求得標準曲線方程和相關系數；

步驟b2，活性測定；

取50μL待測酶混合液與100μL果膠溶液(5g/L)放入1.5mL離心管中，加入100μL的乙酸-乙酸鈉溶液(PH4.8，0.2mol/L)，進行反應，對照組加入50μL不含消化酶的營養液，沸水終止反應；以不含消化酶的營養液為對照；再取反應液100μL加蒸餾水150μL和顯示劑DNS溶液(3g/L)150μL，沸水浴5min，立即冷卻，以不含消化酶的營養液空白調零，重復10次，在分光光度計540nm下測定待測酶混合液的OD值；

步驟c，淀粉酶活性測定；

步驟c1，制作標準曲線；

首先配制濃度為5.0mg/mL的麥芽糖標準溶液10mL，測定時分別稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL；依次取上述溶液40μL分別置于1.5mL離心管中，每管各加入40μL顯色劑DNS(3g/L)，然后置于沸水浴5min， 冰浴冷卻后再加入蒸餾水160μL，于分光光度計490nm處測OD值；

步驟c2，活性測定：

取20μL濃度為1％的淀粉溶液于1.5mL離心管中，加入20μL制備好的待測酶混合液，對照組加入20μL不含酶的營養液，混合均勻，于29℃溫浴3min后，再加入40μL顯示劑DNS(3g/L)和160μL蒸餾水，于分光光度計490nm處分別測定兩組OD值，重復10次。

進一步，在上述步驟a中，所述培養箱施以溫度為25℃±1℃，光周期為16L∶8D。