[發(fā)明專利]一種紅掌細胞核懸液制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410115783.8
• 申請日: 2014-03-26
• 公開（公告）號: CN103940646A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金亮;田丹青;李小白;葛亞英;劉建新;沈福泉;王煒勇
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究開發(fā)中心
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種適用于流式細胞儀分析的紅掌細胞核懸液制備方法。

背景技術(shù)

紅掌（Anthurium?andraeanum），其花朵獨特，有佛焰花序，色澤鮮艷華麗，色彩豐富，葉形苞片，常見的苞片顏色有紅色、粉紅、白色等，有極大的觀賞價值，是世界著名花卉。普遍認為目前紅掌栽培品種的遺傳背景狹窄，新品種培育也因此受到限制。隨著研究深入，使用流式細胞儀進行花藥培養(yǎng)植株倍性鑒定、基因組大小測定以及細胞周期等應(yīng)用和基礎(chǔ)研究對拓寬紅掌育種基礎(chǔ)具有重要意義。而其中獲得適用于流式細胞儀分析的紅掌細胞核懸液成為其中關(guān)鍵技術(shù)。

紅掌葉片含有較多次生代謝物質(zhì)，采用已報道的方法難以獲得適用于流式細胞儀分析的紅掌細胞核懸液，或相關(guān)方法繁瑣、含有對人體有害的試劑，這些都阻礙了相關(guān)研究的進行。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種紅掌細胞核懸液制備方法，該方法高效、快捷、經(jīng)濟。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

?一種紅掌細胞核懸液制備方法，步驟如下：

1）取紅掌嫩葉50?mg，置于塑料培養(yǎng)皿中加入1?ml提取液，所述提取液主要由終濃度如下的組分組成：21g/L一水檸檬酸，10g/L聚乙烯吡咯烷酮K-40；

2）使用刀片在提取液中切碎紅掌嫩葉，然后收集提取液經(jīng)350?目尼龍網(wǎng)過濾，獲得紅掌細胞核懸液。

在步驟2）所述的紅掌細胞核懸液中加入DNA熒光染料碘化丙錠(?propidium?iodide?,?終濃度為50μg/?ml)，?及Rnase?(終濃度為50μg/?ml)，染色后的提取液用于流式細胞儀的檢測。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在于：

1）最大限度地減少了有害試劑的使用，如巰基乙醇，減輕了提取液對人體的危害；

2）提取液成分簡單，只有兩種，均為常規(guī)實驗室試劑，成本低廉，配置容易，可大大降低成本；

3）步驟簡單，無需離心，節(jié)省了時間提高了效率，可以在短時間內(nèi)獲得細胞核懸液用于流式細胞儀檢測；

4）可獲得較高質(zhì)量細胞核懸液用于流式細胞儀檢測。

附圖說明

圖1?采用本發(fā)明制備的紅掌細胞核懸液流式細胞儀分析直方圖；

圖2?采用LB01法制備的紅掌細胞核懸液流式細胞儀分析直方圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于此：

實施例1

??一、試劑的配置

?1）細胞核提取液配置：稱取2.1g一水檸檬酸、1g聚乙烯吡咯烷酮K-40于一干凈的250ml燒杯中，加超純水定容到100ml。用0.22微米濾膜過濾后4度保存?zhèn)溆谩?/p>

2）熒光染料配置：稱取25mg碘化丙錠、25mg核糖核酸酶于一干凈的250ml燒杯中加超純水定容到50ml。用0.22微米濾膜過濾后4度保存?zhèn)溆谩?/p>

二、紅掌細胞核懸液提取方法

（1）取紅掌嫩葉（約50?mg），置于塑料培養(yǎng)皿中加入1?ml提取液。（2）使用鋒利剃須刀片在提取液中切碎葉片；（3）收集提取液經(jīng)350?目尼龍網(wǎng)過濾，獲得紅掌細胞核懸液；（4）過濾后的提取液中加入DNA熒光染料碘化丙錠（終濃度為50μg/?ml）及Rnase?（終濃度為50μg/?ml）。染色后的提取液上流式細胞儀檢測。

紅掌細胞核懸液的流式細胞儀檢測

?采用Quanta?SC流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司），在488?nm?激光的激發(fā)下發(fā)出桔紅色熒光，由FL2?通道檢測出熒光強度。從隨機軟件CellLab?Quanta?SC?獲取數(shù)據(jù),并通過ModFit?LT軟件顯示直方圖（橫坐標以DNA相對含量反映熒光曲線的面積縱坐標為細胞核次數(shù)），結(jié)果見圖1。本發(fā)明制備的紅掌細胞核懸液不僅適用Quanta?SC流式細胞儀，也適用于FACSCalibur（美國Becton-Dickinson?公司）?等目前市場是所有具有488nm激光器的流式細胞儀。

對比例1：采用已報道的LB01法（Dolezel?J,?Binarova?P,?Lucretti?S.?Analysis?of?nuclear?DNA?content?in?plant?cells?by?flow?cytometry.?Biologia?Plantarum?1989,?31:?113?-?120）提取紅掌細胞核懸液經(jīng)流式細胞儀檢測的直方圖，結(jié)果見圖2。無明顯熒光峰，碎片較多，無法用于相關(guān)研究。