[發明專利]GDF15受體下游信號因子的鑒定方法

在審

• 申請號: 201410107938.3
• 申請日: 2014-03-21
• 公開（公告）號: CN104928312A
• 公開（公告）日: 2015-09-23
• 發明（設計）人: 李斌;殷淑英;林芳;李孔晨;李丹
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海巴斯德研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;G01N33/53;C12N5/0783
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明涉及生物工程和分子生物學領域。更具體而言，本發明涉及GDF15受體下游信號因子的鑒定及應用。

背景技術

生長分化因子15(GDF15)是轉化生長因子β(TGF-β)超家族的一員，具有典型的TGF-β超家族蛋白結構特點。GDF15在胚胎的生長發育，細胞對壓力信號的反應，炎癥和組織損傷后修復的過程中均起著重要作用。TGF-β是一個多功能細胞因子，可以影響多種細胞的生長、分化及凋亡。在免疫系統中，TGF-β能夠誘導Foxp3在CD4+CD25-T細胞中的表達，使細胞分化為iTreg。GDF15基因的GenBank登錄號為：NM_004864.2，蛋白的GenBank登錄號為：NP_004855.2。

GDF15在靜態細胞中的表達量往往比較低，但是許多細胞壓力信號都可以使GDF15的表達量突然提高，例如在炎癥、病毒感染、急性組織損傷等情況下或在腫瘤惡化過程中。許多信號通路都與GDF15的表達、分泌及其在細胞基質中的儲存的調節有關，并調節GDF15的功能。GDF15的表達受P53、Sp1、Sp3、Nkx-2、NF-κB、AP-1等多個轉錄因子的調控，P53對GDF15的調控作用與其在抑制腫瘤轉移和促進凋亡方面密切相關。GDF15的啟動子區具有兩個P53的結合位點，其啟動子激活具有顯著的P53濃度依賴性和P53轉錄結合位點依賴性。在人卵巢癌和前列腺癌細胞中，GDF15作為P53的下游因子被誘導表達，可以降低癌細胞的轉移。此外，許多其它轉錄因子也能誘導GDF15在一定類型的細胞中表達，例如在乳腺癌細胞中，Akt的激活能夠上調GDF15的表達。在黑色素細胞中，紫外線照射能夠明顯上調GDF-15的mRNA水平，而在黑色素瘤細胞系中，通過激活MAPK和MITF也能夠明顯上調GDF-15的mRNA水平。

GDF15通過自分泌和旁分泌的作用發揮抗炎癥反應、抑制生長、促進腫瘤細胞凋亡等功能。作為TGF-β超家族的一員，GDF15可通過依賴或非依賴Smad的方式傳導信號，也可通過激活其它的信號元件來發揮功能，如PI3K/Akt、FAK-RhoA、Ras/MAPKs等。雖然GDF15的受體還沒有被鑒定出來，但是作為TGF-β超家族的一員，在某些細胞中GDF15能夠通過激活TGF-β的I型和II型受體及細胞內的Smad蛋白復合物來介導細胞的反應。Yi?Sun等證明GDF15蛋白或轉染的GDF15能夠抑制前列腺癌細胞系的生長，該過程的信號通路與TGF-β的相似，GDF15能夠對存在完整TGF-β信號通路的癌細胞系的生長起到抑制作用，但是不能對TGF-βI型和II型受體突變細胞或Smad4失活細胞起到抑制作用。GDF15在培養的新生兒心肌細胞中的表達能夠通過激活Smad2/3的信號通路起到誘導抗心肌肥厚反應，通過過表達Smad6/7可以消除GDF15的此種作用。在肝癌細胞中，GDF15通過Akt及其下游信號通路的磷酸化來介導其功能。SK?Batra等證明在前列腺癌細胞中，GDF15能夠通過激活FAK-RhoA信號通路，介導肌動蛋白的調整，從而影響癌細胞的遷移。在乳腺癌細胞中，目前已知GDF15能夠激活ErbB家族受體酪氨酸激酶，并能夠通過反式激活ErbB2而激活Erk1/2和Akt，從而激活乳腺癌細胞的侵襲潛能。

綜上所述，GDF15在多種癌癥的發生發展過程發揮著重要的作用，在癌癥發生發展的不同階段均發揮著重要的作用，但由于其精確受體目前尚未鑒定，所以在分子機制上研究GDF15如何發揮其多樣性功能至關重要，這將為基礎分子免疫研究轉化為臨床研究，以及多種癌癥如乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多種癌癥的治療提供新的藥物靶點。此外，Treg細胞在癌癥的發生發展及逃逸過程中均發揮著重要的功能，而TGF-β對調節性T細胞的分化及功能發揮有著重要的作用。

因此，了解作為TGF-β家族的GDF15蛋白對調節性T細胞作用將有利于進一步研究GDF15在不同的癌癥發展過程通過調節免疫系統發揮的功能。

發明內容

本發明的目的在于提供GDF15受體下游信號因子的鑒定及應用。

在本發明的第一方面，提供一種制備生長分化因子15(GDF15)胞外區的方法，所述方法包括：

(1)提供一表達構建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件：His標簽序列，FLAG標簽序列，TEV蛋白酶體識別序列，鈣調素結合蛋白(CBP)的基因序列，生長分化因子15胞外區序列；