[發明專利]豬圓環病毒2型高敏感性PK15細胞系L8的制備方法

無效

• 申請號: 201410104575.8
• 申請日: 2014-03-20
• 公開（公告）號: CN103898044A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 侯賢敏;郭敬;崔保安;郭官鵬;陳紅英
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12R1/91
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 張紹琳;張真真

技術領域

本發明涉及促進2型豬圓環病毒體外細胞增殖技術領域。具體涉及豬圓環病毒2型高敏感性單細胞株的篩選及培養。

背景技術

豬圓環病毒2型(porcine?cirovirus?type?2，PCV2)可引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征、增生性壞死性肺炎、母豬繁殖與呼吸綜合征、豬皮炎與腎病綜合征和仔豬傳染性先天性震顫等多種疾病，其中斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）最為常見且該病在世界范圍內廣泛流行，給各國養豬業造成了巨大的損失。此外，豬圓環病毒2型又常造成其他細菌或病毒的并發或繼發感染，從而增加了豬傳染病的預防和控制難度。

由于豬圓環病毒2型體外細胞增殖比較困難，其病毒滴度一般都在10^4.0?—10^5.0TCID₅₀/mL之間，免疫熒光染色顯示接種PCV2的PK15細胞中僅有20%左右的細胞對PCV2易感。這可能是制約PCV2全病毒滅活苗疫苗開發的技術瓶頸，因此研究提高PCV2在細胞內增殖滴度的方法成了國內外學者研究的熱點和難點，同時也成為了全病毒滅活苗開發所需要克服的最大障礙。

發明內容

本發明的目的是獲得對豬圓環病毒2型具有較高敏感性的細胞株，通過對該細胞株的克隆、篩選與生物學特性的測定進一步驗證其功能，并增殖獲得具有較高滴度的豬圓環病毒2型細胞毒。

本發明涉及基于對所篩選出的細胞生物特性以及其對豬圓環2型病毒增殖促進情況的檢測。所述的克隆細胞能夠提高豬圓環病毒2型的體外增殖能力和滴度，有利于進一步研究豬圓環病毒2型體外復制、體外診斷及開發通過懸浮培養技術制備高效價PCV2全病毒滅活疫苗。

本發明的技術方案是：通過系列稀釋法克隆獲得單細胞株，并進一步通過間接免疫熒光（IFA）篩選出對PCV2高敏感性的單細胞株。一種豬圓環病毒2型高敏感性PK15細胞系L8的制備方法，它的步驟如下：

（1）將PK15細胞復蘇后培養于細胞瓶中長成細胞單層，用質量分數為0.25%的胰酶消化，然后加入DMEM生長液吹打，所述DMEM生長液含質量分數為10%的胎牛血清和質量分數為1%的雙抗，分散細胞成單個，用系列稀釋法進行細胞克隆；

（2）通過間接免疫熒光篩選出對PCV2高敏感性的單細胞株。

所述步驟（1）中用系列稀釋法進行細胞克隆的步驟如下：

①?將PK15細胞稀釋到5x10^4?至?1x10⁵cells/mL，在96孔板中，除了A1孔其他所有孔用八孔排槍加入100μL?DMEM生長液，取稀釋好的PK15細胞液200μL加入到A1孔中；

②?第一系列的稀釋：如圖1中豎向箭頭所示，在A1孔中取100μL?至B1中進行倍比稀釋，用槍吸吹混勻，同樣取100μL至C1孔中，以此類推進行倍比稀釋至H1孔后，最后從H1孔中取出100μL細胞混合液棄掉；

第二系列的稀釋：如圖1中橫向箭頭所示，在第一系列稀釋完之后，用八孔排槍取100μL細胞培養液加入到第一排中進行倍比稀釋并吸吹混勻之后，再從第一排孔中取100μL細胞混合液至第二排中進行同樣操作；同樣進行倍比稀釋至第十二排孔，棄掉最后取出的100μL細胞混合液；

③?在96孔板中補加DMEM生長液至200μL，將培養板置于37℃?5%CO₂培養箱中培養，培養4—5d時可在顯微鏡下挑出單克隆細胞孔并分別按照挑選的前后順序命名為L1、L5、L6、L8、L12和L15，繼續培養10d即細胞長滿孔的1/3-1/2面積時可將細胞轉至24孔板中培養，細胞在24孔板中長滿后可轉至6孔板中培養，細胞在6孔板中長滿再轉至25cm²的細胞瓶中培養，在細胞培養過程中2—3d更換一次DMEM生長液，將培養的單細胞克隆凍存。

本發明的有益效果是：本發明采用更為方便高效的單細胞克隆技術獲得一株對PCV2具有更高感染率的細胞系，命名為L8。通過對該細胞系的穩定性以及純凈性檢測發現該細胞系能夠穩定的提高PCV2在細胞內的增殖滴度。