[發(fā)明專利]一種基于魯米諾和聯(lián)吡啶釕的電位分辨電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410104233.6
• 申請(qǐng)日: 2014-03-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103884707A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方丹君;江德臣;姜暉;韓芳霏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/76
• 分類號(hào): G01N21/76;G01N33/574
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

1.一種基于魯米諾和聯(lián)吡啶釕的電位分辨電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，其特征在于，以魯米諾和聯(lián)吡啶釕為發(fā)光探針，在檢測(cè)時(shí)包括如下步驟：

（1）電極準(zhǔn)備：在ITO電極表面粘上O型圈作為溶液室，以ITO電極作為發(fā)光檢測(cè)的工作電極，以銀-氯化銀電極作為參比電極，以鉑電極作為對(duì)電極；

（2）正電位下檢測(cè)魯米諾的發(fā)光信號(hào)：以-0.01～-1V/s的掃速由0.6V掃描至0.0V，檢測(cè)來(lái)自魯米諾的發(fā)光信號(hào)；

（3）負(fù)電位下檢測(cè)聯(lián)吡啶釕的發(fā)光信號(hào)：向檢測(cè)體系中加入過(guò)硫酸根和過(guò)量的魯米諾，以-0.01～-1V/s的掃速由0.0V掃描至-1.0V，檢測(cè)來(lái)自聯(lián)吡啶釕的發(fā)光信號(hào)；

其中，所述魯米諾的檢測(cè)范圍為20μM～200μM，所述聯(lián)吡啶釕的檢測(cè)范圍為20μM～200μM；加入的過(guò)硫酸根與聯(lián)吡啶釕的摩爾比為20:1～30:1，加入的過(guò)量的魯米諾的量為15～20mM。

2.權(quán)利要求1所述的方法在同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞表面兩種抗原上的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟：

（1）電極準(zhǔn)備：在ITO電極表面粘上O型圈作為溶液室，以ITO電極作為發(fā)光檢測(cè)的工作電極，以銀-氯化銀電極作為參比電極，以鉑電極作為對(duì)電極；

（2）將細(xì)胞表面待測(cè)的抗原A和抗原B分別用聯(lián)吡啶釕和魯米諾標(biāo)記；

（3）對(duì)細(xì)胞表面的聯(lián)吡啶釕和魯米諾進(jìn)行檢測(cè)，其中，以-0.01～-1V/s的掃速由0.6V掃描至0.0V，檢測(cè)來(lái)自魯米諾的發(fā)光信號(hào)；向檢測(cè)體系中加入過(guò)硫酸根和過(guò)量的魯米諾溶液，以-0.01～-1V/s的掃速由0.0V掃描至-1.0V，檢測(cè)來(lái)自聯(lián)吡啶釕的發(fā)光信號(hào)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（2）中，標(biāo)記聯(lián)吡啶釕和魯米諾的步驟如下：

（a）細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞在步驟（1）所述的ITO電極的表面培養(yǎng)，并用2.5wt%的戊二醛進(jìn)行固定；

（b）制備鏈霉親和素修飾的聯(lián)吡啶釕復(fù)合物：將鏈霉親和素與聯(lián)吡啶釕在3～5℃下反應(yīng)2～3小時(shí)得到結(jié)合產(chǎn)物SA-Ru，結(jié)合產(chǎn)物用超濾管進(jìn)行超濾純化處理，然后在4℃下于pH7.4的PBS緩沖液中保存；

（c）制備抗體B修飾的魯米諾復(fù)合物：將3-巰基丙酸加入到金納米顆粒溶液中在35～38℃下反應(yīng)10～12小時(shí)，在轉(zhuǎn)速為14000rpm條件下離心25～40分鐘收集金納米粒子軛合物，向金納米粒子軛合物中加入EDC和NHS的混合溶液，在36～38℃下反應(yīng)0.8～1.5小時(shí)，得到活化的金納米粒子溶液；將活化的金納米粒子溶液與抗體B溶液混合，在36～38℃下反應(yīng)11～13小時(shí)得到金納米粒子-抗體B復(fù)合物；將N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾加入到金納米粒子-抗體B復(fù)合物中，在黑暗條件下反應(yīng)11～13小時(shí)得到抗體B修飾的魯米諾復(fù)合物；

（d）標(biāo)記鏈霉親和素修飾的聯(lián)吡啶釕復(fù)合物：將（a）中固定有細(xì)胞的ITO電極與生物素化的抗體A溶液于37℃條件下反應(yīng)25～40分鐘，用pH7.4的PBS緩沖液清洗，加入步驟（b)中得到的SA-Ru溶液反應(yīng)2～4分鐘從而在抗原A上標(biāo)記上鏈霉親和素修飾的聯(lián)吡啶釕復(fù)合物；

（e）標(biāo)記抗體B修飾的魯米諾復(fù)合物：將經(jīng)過(guò)（d）步驟處理的ITO電極的O型圈表面加入0.02%（w/v）的吐溫20溶液，然后與步驟（c）制備的抗體B修飾的魯米諾復(fù)合物在37℃下反應(yīng)2小時(shí)，從而在抗原B上標(biāo)記上抗體B修飾的魯米諾復(fù)合物。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述O型圈的直徑為2cm。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的細(xì)胞為MCF-7細(xì)胞，所述的抗原A為癌胚抗原，抗原B為甲胎蛋白。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的PBS緩沖液為pH7.4的PBS緩沖液。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的金納米顆粒的粒徑為11～13nm。