[發明專利]一種抗菌肽活性檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201410103880.5
• 申請日: 2014-03-20
• 公開（公告）號: CN103911423B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發明（設計）人: 李鋼;鄒輝琴;溫靜
• 申請（專利權）人: 四川華德生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙)51222
• 代理人: 全學榮,張娟

技術領域

本發明涉及一種抗菌肽活性檢測試劑盒及檢測方法。?

背景技術

抗菌肽的活性檢測通常采用管碟法，管碟法是根據抗生素在瓊脂平板培養基中的擴散滲透作用，比較標準品和待檢品兩者對指示菌的抑菌圈大小來測定待檢品的效價。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性試驗菌的瓊脂平板上放置牛津杯，杯內放入標準品和待檢品的溶液，經16～18小時恒溫培養，抗生素擴散的有效范圍內則產生透明的無菌生長的區域，常呈圓形，稱為抑菌圈。抑菌圈直徑大小與抗生素效價相關，比較抗生素標準品與檢品的抑菌圈大小，可計算出抗生素的效價。?

使用管碟法進行檢測時，需要制備新鮮的瓊脂溶液，即將瓊脂粉加熱至95℃以上制成瓊脂溶液，滅菌后，降低溫度，在適當溫度下加入指示菌進行檢測。然而，對于試驗條件比較差或者完全沒有實驗操作能力的人員來說，難以有效滅菌，同時，因凝膠溶液降溫至40℃以下時形成凝膠，而大部分細菌生長繁殖的適宜溫度通常為20～40℃，若在40℃以下加入指示菌，則指示菌與凝膠狀的瓊脂不能有效混勻，導致指示菌分布不均，致使檢測結果不準確，若在40℃以上加入指示菌，將導致指示菌難以有效生長，降低檢測效率或者導致檢測失敗。?

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種新的瓊脂溶液，以及包含該瓊脂溶液的抗菌肽活性檢測試劑盒。?

本發明瓊脂溶液，它包括瓊脂與強堿，其中，瓊脂的濃度為2～3%（w/v），強堿的濃度不低于0.8mol/L。?

w/v，即g/ml。?

強堿，溶于水能發生完全電離的堿，如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、。?

其中，所述瓊脂的濃度為3%（w/v）。?

其中，所述強堿為氫氧化鈉，濃度不低于1.0mol/L。?

其中，所述強堿為氫氧化鉀，濃度為0.8～1.0mol/L。?

本發明還提供了一種制備前述瓊脂溶液的方法，步驟如下：按照前述配比取原料，混勻，滅菌，即可。?

本發明抗菌活性檢測試劑盒，可用于檢測品（如，抗菌肽）的抗菌活性，它包括如下組分：?

指示菌；?

營養液：指示菌的液體培養基；?

基質液：前述瓊脂溶液；?

稀釋液：強酸溶液。?

強酸，溶于水能發生完全電離的酸，如，磷酸、鹽酸或者硝酸、硫酸。?

其中，所述指示菌中，活菌數為10⁷～10⁸個/g。?

其中，所述指示菌為大腸桿菌時，營養液是LB液體培養基。?

LB液體培養基，大腸桿菌常用的培養基，其制備方法：取胰蛋白胨(Tryptone)10g、酵母提取物(Yeast?extract)5g、氯化鈉(NaCl)10g，定容至1L，調pH7.0，121℃滅菌15分鐘，即得。?

優選地，所述強酸溶液是磷酸溶液、鹽酸溶液或者硝酸溶液。?

優選地，所述強酸溶液的濃度為0.3～0.4mol/L。?

本發明使用前述試劑盒檢測樣品（如，抗菌肽）的抗菌活性的方法，包括如下步驟：?

（1）取待檢樣品，制成樣品溶液；?

（2）取指示菌，加入營養液，制成菌懸液；?

（3）在溫度大于等于20℃的條件下，往基質液中加入稀釋液至溶液pH為5-7，再加入步驟（2）的菌懸液，混勻，倒入培養皿中；?

（4）待培養皿中的溶液凝固后，倒置培養，放入牛津杯，在牛津杯中加入步驟（1）制備的樣品溶液，培養，觀察抑菌圈大小，即可。?

本發明瓊脂溶液pH值高，不易染菌，可以長時間放置，用于抗菌肽檢測時，無需滅菌，對實驗條件和實驗者操作技巧的要求低，同時，其在溫度為20℃時，即呈液態，在較低溫度（20℃）下加入指示菌也可以充分混勻，能夠在保證指示菌與瓊脂溶液混勻的同時維持指示菌的正常生長。采用本發明試劑盒檢測抗菌肽活性，無需配制新鮮瓊脂溶液，對實驗條件的要求低，操作簡便，普通人即可使用，實用性強，檢測結果準確可靠，具有良好的應用前景。?

顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。?

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。?

附圖說明

圖1本發明檢測方法可靠性的結果圖