[發明專利]一株具有脅迫耐受性的重組釀酒酵母菌株

有效

• 申請號: 201410103468.3
• 申請日: 2014-03-19
• 公開（公告）號: CN103849576A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發明（設計）人: 趙心清;張明明;白鳳武
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/63;C12R1/865
• 代理公司: 大連星海專利事務所 21208
• 代理人: 花向陽

技術領域

本發明涉及一株具有脅迫耐受性的重組釀酒酵母菌株（4126-SET5），屬于微生物技術領域。

背景技術

釀酒酵母廣泛應用于食品、釀造及生物能源生產等不同領域，良好的細胞活性有利于增加生物量的積累，促進細胞循環使用，提高發酵效率，但釀酒酵母在生長和發酵過程中，尤其是在工業生產條件下，經常受到高濃度乙醇、極端溫度（冷凍或高溫等），低pH及高滲透壓等環境脅迫因素的影響，這些環境脅迫條件抑制細胞生長及代謝，從而影響了生產效率（Journal?of?Biotechnology，2009，144：23-30）。因此，釀酒酵母細胞對環境脅迫因素的反應和耐受性機制一直是國內外學者研究的重點。

隨著經濟的快速發展，我國能源短缺問題不斷突出。第二代生物乙醇以纖維素原材料，包括農作物秸稈，林業廢棄物等發酵生產乙醇。與第一代生物乙醇不同之處在于，纖維素乙醇避免了與人爭糧，與糧征地的弊端。在纖維素乙醇生產中，原料預處理過程中產生的弱酸類﹑醛類和酚類等抑制物對細胞的生長和發酵具有抑制作用（Biotechnology?for?Biofuels，2009，2：1-11）。為減小抑制劑的影響所采取的一些脫毒策略往往造成糖的損失和生產成本的增加,這在實際生產與經濟上是不可行的，因而具有高耐受性的菌株的選育成為必要。近年來,通過細胞全局基因表達分析和各種組學數據分析（Antonie?van?Leeuwenhoek，2013，103：1281-1295）,以及對單基因敲除的所有突變體的表型組研究（Microbial?Cell?Factories，2010，9：79），對釀酒酵母乙酸耐性的分子機制有了更多新的認識,揭示了很多新的與乙酸毒性的適應性反應和乙酸耐性提高相關的基因。本發明得到的重組釀酒釀酒酵母就是以此獲得，且本菌株具有較強的乙酸耐受性。

纖維素預處理的現在多通過物理、化學和生物方法實現，但是通過化學、物理方法的預處理需要消耗太多的能源且處理的過程中產生大量的污染物。生物酶解的過程比較溫和，這一過程需要多種酶的參與，通過內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶把纖維素酶解成酵母細胞能夠利用的糖類。此過程比較復雜，更重要的是水解產生的糖類對生物酶的活性有明顯的抑制作用，因而同步糖化發酵（SSF）是必然的一種趨勢，此過程可以減少纖維素乙醇發酵中的能耗，并且降低菌體污染的可能性。然而在較低的溫度下，纖維素酶的水解效率會非常低，綜合考慮水解和發酵過程（Biotechnology?Advances，2012，30：1207–1218），耐高溫酵母是一種必然的需求。本發明得到的重組釀酒酵母菌株能在較高溫度下良好生長，可用于高溫發酵。

發明內容

本發明的目的在于構建一株具有脅迫耐受性的重組釀酒酵母菌株，能在分別含有高濃度乙酸、過氧化氫、乙醇和高溫等環境脅迫條件下良好生長，并能在較強的環境脅迫條件下，比如高濃度乙酸條件下具有較高的乙醇發酵效率。

本發明涉及一株具有脅迫耐受性的重組釀酒酵母菌株（4126-SET5），該菌株分類命名為Saccharomyces?cerevisiae，菌株的登記入冊編號為CGMCC?No.8724，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2014年01月15日。

所述菌株SET5基因來源于實驗室模式釀酒酵母S288c，將PCR擴增得到的SET5基因連接到pHO組成型整合表達載體（Applied?Energy,2012,110：33-40），線性化后轉入工業釀酒酵母，實現整合表達。

所述具有脅迫耐受性的重組釀酒酵母菌株（4126-SET5）根據已有的轉錄組分析結果，選擇變化顯著的靶點SET5基因，該基因序列的GenBank登錄號為NC_001140.6。PGK1啟動子序列GenBank登錄號為FJ415226.1，CYC1終止子序列GenBank登錄號為EF210198.1。通過基因工程手段在酵母的HO整合載體（NCBI：#AF324728，美國Utah大學David?J.Stillman惠贈；Nucleic?acids?research，2001,29：e59）的基礎上連接PGK1強啟動子和CYC1終止子構成pHO組成型表達載體。然后把PCR擴增獲得的SET5基因連接在PGK1啟動子和CYC1終止子之間，線性化后電轉導入工業釀酒酵母4126中，進行過表達。導入的質粒會在釀酒酵母基因組的HO基因位點（Yeast,1997,13：1563-1573）整合表達。