[發(fā)明專利]一株具有乙酸耐受性的工業(yè)釀酒酵母菌株

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410102837.7
• 申請日: 2014-03-19
• 公開（公告）號: CN103820347A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設計）人: 趙心清;魏小文;白鳳武
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12R1/865
• 代理公司: 大連星海專利事務所 21208
• 代理人: 花向陽

技術領域

本發(fā)明涉及一株具有乙酸耐受性的工業(yè)釀酒酵母菌株（4126-YHB1），屬于微生物技術領域。?

背景技術

由于化石燃料的儲備量不斷減少和國際原油價格的不穩(wěn)定等因素，國內外對于可再生清潔能源的需要日益增加，生物燃料是具有良好發(fā)展前景的可再生能源。除了具有可再生能源的一般優(yōu)點外，生物燃料還可以減輕由化石燃料所引起的一系列問題，尤其可降低氣體排放所引起的溫室效應。在眾多類型的生物燃料中，燃料乙醇表現(xiàn)出了巨大優(yōu)勢（Applied?Microbiology?and?Biotechnology,2009,85:253-263）。乙醇不僅是一種優(yōu)良燃料，也是一種優(yōu)良的燃油品質改善劑，同時又具有極好的抗爆性能。我國擁有豐富的纖維素生物質資源，如果能夠充分有效地利用這些原料生產(chǎn)燃料乙醇，既可以保護環(huán)境，還可以解決利用淀粉質原料生產(chǎn)乙醇產(chǎn)生的與人爭糧，與糧爭地的弊端。利用纖維素為原材料生產(chǎn)乙醇有利于經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展，同時也可以降低我國對于進口石油能源的依賴，保障國家的能源安全。?

木質纖維素生物煉制乙醇過程中，由于原料中纖維素、半纖維素和木質素之間致密的結構，不利于纖維素酶對纖維素的水解，因此，木質纖維素在酶水解前必須經(jīng)過預處理以提高纖維素對纖維素酶的可及度。稀酸和蒸汽爆破預處理是目前研究較多的預處理方法，在稀酸和蒸汽爆破預處理過程中，由于酸和熱的作用，原料中部分碳水化合物發(fā)生降解和分解作用，產(chǎn)生甲酸、乙酸等一?系列對后續(xù)發(fā)酵有害的物質，其中乙酸是主要的發(fā)酵抑制物，含量較高(生物工程學報,2014,30:368-380)。木質纖維素預處理所產(chǎn)生的抑制劑會影響酵母的正常生長和后續(xù)的發(fā)酵過程。為減小抑制劑的影響所采取的一些脫毒策略往往造成糖的損失和生產(chǎn)成本的增加，影響了生產(chǎn)的經(jīng)濟性。因此，選育具有強的抑制劑耐受性，包括具有強的乙酸耐受性的釀酒酵母菌株對于提高纖維素乙醇產(chǎn)率十分重要。?

通過尋找與細胞脅迫耐性相關的基因，對釀酒酵母菌進行代謝工程改造，可提高細胞在環(huán)境脅迫條件下的細胞活性，從而提高發(fā)酵效率。YHB1基因參與編碼抑制一氧化氮毒性的黃素血紅蛋白(Proceedings?of?the?National?Academy?of?Sciences,1992,89:5015-5019)，黃素血紅蛋白可以保護細胞免受硝酸化脅迫壓力。敲除了YHB1基因的細胞無法清除一氧化氮，黃素血紅蛋白在無氧及有氧條件下均可保護細胞免受一氧化氮及硝酸鹽脅迫作用(Proceedings?of?the?National?Academy?of?Sciences,2000,97:4672-4676)。此外，黃素血紅蛋白不僅與氮化脅迫相關，其在消除氧化脅迫方面也有顯著作用(Journal?of?Biological?Chemistry,2005,280:7645-7653)。但是該基因在乙醇及乙酸耐受性方面的研究很少，目前未見到有關于該基因的表達可提高乙酸耐受性的報道。?

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于構建一株具有乙酸耐受性的重組釀酒酵母菌株，從而可以在高濃度乙酸抑制物存在條件下快速高效的進行乙醇發(fā)酵。?

本發(fā)明涉及一株具有乙酸耐受性的重組釀酒酵母菌株（4126-YHB1），該菌株分類命名為Saccharomyces?cerevisiae，菌株的登記入冊編號為CGMCC?No.?8725，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2014年1月15日。?

所述菌株基因來源于實驗室模式釀酒酵母S288c，將PCR擴增得到的YHB1基因連接到pHO組成型整合表達載體，線性化后轉入工業(yè)釀酒酵母，實現(xiàn)整合表達。?

所述具有耐乙酸的重組釀酒酵母菌（4126-YHB1）過表達黃素血紅蛋白YHB1基因，YHB1基因序列的GenBank登錄號為NC_001139。PGK1啟動子序列GenBank登錄號為FJ415226.1，CYC1終止子序列GenBank登錄號為EF210198.1。通過基因工程手段在酵母的HO整合載體（NCBI：#AF324728，美國Utah大學David?J.Stillman惠贈；Nucleic?acids?research,2001,29:e59）的基礎上連接PGK1強啟動子和CYC1終止子構成pHO組成型表達載體（Applied?Energy,2012,110：33-40）。然后把PCR擴增獲得的YHB1基因連接在PGK1啟動子和CYC1終止子之間，線性化后電轉導入工業(yè)釀酒酵母4126中，進行插入基因的過表達。?