[發明專利]一種硼酸介導的聚合酶鏈反應檢測DNA中5?羥甲基胞嘧啶的方法

有效

• 申請號: 201410102734.0
• 申請日: 2014-03-19
• 公開（公告）號: CN104928351B
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: 汪海林;趙超;趙柏林;李翠平
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，是一種非診斷目的的快速、準確、高效檢測和定位特定基因/片段中5-羥甲基胞嘧啶的生化分析方法。

背景技術

5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)是繼5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)之后發現的第六種堿基，已在多種哺乳動物組織和細胞中檢出。與5mC相比，5hmC的含量更低(2009年，Heintz研究組利用薄層色譜和質譜等分析方法，在人、小鼠大腦以及胚胎干細胞中檢測到5hmC，皮質和腦干區5hmC表達豐富，浦肯野細胞中5hmC的含量約占總核苷酸的0.6％，在顆粒細胞中約占0.2％；S.Kriaucionis，N.Heintz，Science，2009，324：929-930)，但5hmC也同樣具有非常重要的生物學功能。

現有的研究已經表明5hmC和TETs參與了基因組重新編程、基因表達的轉錄調控，并在DNA去甲基化過程中發揮重要作用。2011年，研究發現TET蛋白可將5hmC轉變成5-甲酰胞嘧啶(5-formylcytosine，5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5caC)。此兩種堿基修飾產物都可以在基因組DNA中檢測到，并且5hmC、5fC和5caC的基因組含量與TET蛋白的表達量有關。5fC和5caC的發現提示了一種新的主動去甲基化通路(5mC→5hmC→5caC→C)，為研究DNA去甲基化作用及生理功能指明了方向。5mC首先氧化為5hmC，并進一步氧化為5fC和5caC(S.Ito，L.Shen，Q.Dai，S.C.Wu，L.B.Collins，J.A.Swenberg，C.He，Y.Zhang，Science，2011，333：1300-1303)。而5fC和5caC可被一種重要的胸腺嘧啶DNA糖基化酶(Thymine DNA Glycosylase，TDG)識別并切除，形成非堿基位點，最后通過堿基切除修復通路將非堿基位點修復為正常的胞嘧啶。令人感到意外的是，DNA修復通路不僅負責細胞內的DNA損傷的消除而且參與DNA主動去甲基化。再次證明了DNA修復的重要性(Y.F.He，B.Z.Li，Z.Li，P.Liu，Y.Wang，C.He，G.L.Xu，et al.，Science，2011，333：1303-1307)。另外，Xu研究組發現TETs蛋白家族中的TET3在卵細胞重新編程過程中也起到了重要作用(T.P.Gu，F.Guo，H.Yang，G.L.Xu，Nature，2011，477：606-U136)；目前，大量的研究顯示5hmC是5mC在去甲基化過程中的一種重要的中間體，實際上，基因組中5hmC含量較低，與推斷其是一種短暫產生的中間體是相一致的。另外，5hmC在基因調控元件區具有獨特的分布特點，研究發現5hmC和5mC都高度富集于基因內部，尤其是外顯子區，只有5hmC在轉錄起始位點、5’非編碼區富集，在其他基因轉錄調控元件區如增強子、啟動子區域等5hmC表達水平較5mC相對高。綜上，5hmC的生物學功能還不是很明確，但是可以確定的是5hmC和TETs在全基因組的表觀遺傳重組和組織特異性基因表達的調控中起到了非常重要的作用。另外，5hmC可能與特定腫瘤的發生密切相關，有可能成為腫瘤早期診斷的生物標志物。

對5hmC生物學功能的研究離不開高靈敏度、高特異性、高通量的檢測方法。相對于基因組中含量較高的5mC，5hmC含量較低，且兩者結構相似，導致傳統的用于5mC的檢測方法不能應用于5hmC的檢測分析。例如，經典的重亞硫酸鹽測序法?；蚪MDNA經重亞硫酸鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶可通過脫氨基和脫磺酸基作用轉化為尿嘧啶(U)，再經聚合酶鏈反應(PCR)擴增轉變成胸腺嘧啶(T)，而5mC經處理后不能轉化為胞嘧啶(C)，PCR擴增后仍為C，從而可將5mC與未修飾的C區分。但是，5hmC由于不能脫氨基而形成5-亞甲基磺酸胞嘧啶，在重亞硫酸鹽測序中5hmC和5mC都不能脫氨基，從而PCR擴增后二者不能產生序列差異，即5mC和5hmC不能被區分。