[發明專利]重組多刺激分子細胞及其制備方法和在NKT細胞擴增中的應用

有效

• 申請號: 201410102175.3
• 申請日: 2014-03-19
• 公開（公告）號: CN103937747A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 申重陽;朱姣蓮;陳潔
• 申請（專利權）人: 成都康景生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N5/0783
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技術領域

本發明屬于生物技術領域及疾病免疫治療領域，具體涉及一種重組多刺激分子細胞及其制備方法和在NKT細胞體外擴增中的應用。

背景技術

重組多刺激分子細胞的制備原理是模擬T?細胞活化的雙重信號機制，在一定的載體表面展現抗原肽-?MHC?分子復合物及共刺激分子、黏附分子的配體或抗體構建而成，它能有效活化和擴增抗原特異性?T?細胞，而且效率高、可行性好。

目前用于制備重組多刺激分子細胞的載體主要有磁珠、細胞和脂質體三類，以磁珠為載體構建重組多刺激分子細胞雖然來源方便，但價格昂貴，應用于體內，會引起鐵中毒，約束了其醫療應用前景；以脂質體為載體制備過程較為繁瑣，成本較高，涉及脂質材料的購買、不同孔徑大小脂質體的形成及確定等等步驟，且每次應用時必須從頭開始制備，限制其廣泛應用。

CD64?是特異性的細胞毒劑的傳遞者，CD64組成性表達于單核細胞、Mφ及DC細胞；IFN-γ可明顯上調單核細胞CD64的表達，并可誘導中性粒細胞和嗜酸性粒細胞CD64的表達；CD64是高親和力的Ig?Fc-gamma?受體（FcγR?），可介導ADCC，通過IgG的調理促進對顆粒性抗原的吞噬作用，增加吞噬細胞釋放IL-1/IL-6和TNF-α等細胞因子；CD64結合Ig?Fc段后參與信號的傳遞。

CD137是腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族成員，主要參與T細胞的擴增，生成與發育，也可以誘導外周血單核細胞的增殖，在TCR/CD3誘導下可促進T細胞的凋亡，同時可以調節與CD28共刺激的Th1細胞應激反應。TRAF受體蛋白可以與它相互作用，引導信號通路轉向NF-?κB的激活；CD137L?就是與CD137相互作用的蛋白，利用外源表達載體轉染ME64細胞，使CD137L蛋白以及IL-18得以表達，獲得的重組多刺激分子細胞，可以很好的與NKT細胞相互作用，增強NKT細胞的腫瘤細胞靶向殺傷性。

在免疫調節過程中，mIL-18可以抑制癌癥發生，它可以與mIL-12協同作用，誘導Th1細胞生成INF-γ作用于腫瘤細胞；同時，協同mIL-15或者單獨作用，誘導T淋巴細胞的殺傷作用或殺傷性T淋巴細胞的活化；與mIL-12一起可以誘導mIL-13或者其它T淋巴細胞因子的生成。

NKT細胞（natural?killer?T細胞，一群細胞表面既有T細胞受體TCR，又有NK細胞受體的特殊T細胞亞群）是將人外周血單個核細胞在體外用多種細胞因子（如抗CD3單克隆抗體、IL-2和IFN-γ等）共同培養一段時間后獲得的一群異質細胞，由于該種細胞同時表達CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子，故稱之為NK細胞樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤優點；因此，應用NKT細胞被認為是新一代抗腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案。

NKT細胞中的效應細胞CD3+和CD56+細胞在正常人外周血中極其罕見，僅1%—5%，因此如何在體外有效的擴增出大量殺傷力強、數量多的NKT細胞成為臨床應用的關鍵。目前，現有的NKT細胞的體外擴增主要應用外源性細胞因子，如抗CD3McAb和IL-2等，而在腫瘤細胞殺傷過程中，增強NKT細胞的靶向殺傷性以及殺傷效力，顯得尤為重要。

發明內容

本發明的目的是提供一種重組多刺激分子細胞及其制備方法，解決現有技術中重組多刺激分子細胞制備過程復雜、成本高及重復性差的問題。

本發明的另一目的是提供上述重組多刺激分子細胞在NKT細胞體外擴增中的應用，該重組多刺激分子細胞可刺激NKT細胞的大量擴增，抑制NKT?細胞的凋亡，提高NKT細胞的增殖次數及腫瘤細胞殺傷毒性。

為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

提供一種重組多刺激分子細胞，其為能在人急性髓系白血病細胞MEG-01細胞表面穩定表達CD64、CD137L和mIL-18的細胞?，即ME64/CD137L/mIL-18細胞。

制備上述重組多刺激分子細胞的方法，包括以下步驟：

a、構建CD64真核表達載體，將該載體轉染MEG-01細胞，再經篩選，分選，獲得能夠在MEG-01細胞表面穩定表達CD64的細胞，即ME64細胞；

b、制備雙表達CD137L和mIL-18共刺激信號的真核表達載體；

c、將步驟b制得的真核表達載體轉染所述ME64細胞，再經篩選，分選，獲得能夠在ME64細胞表面穩定表達CD137L和mIL-18的細胞，即ME64/CD137L/mIL-18細胞。