[發明專利]一種人血漿中miR-9熒光定量PCR的檢測方法和試劑盒

無效

• 申請號: 201410101603.0
• 申請日: 2014-03-19
• 公開（公告）號: CN103882129A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 田潔;王勝軍;馬斌;芮棵;馬潔;湯新逸;田新宇;沈培;許化溪
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測方法，其特征在于首先設計特異性的“莖環狀”逆轉錄引物以及特異性的miR-9?PCR?擴增引物，然后經逆轉錄、熒光定量PCR程序，最后根據△Ct法計算出miR-9的相對表達量。

2.根據權利要求1所述的一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測方法，其特征在于，其中特異性的miR-9逆轉錄引物的序列如SEQ?ID?NO.1所示；特異性的miR-9?PCR擴增引物序列如SEQ?ID?NO.2和3所示。

3.根據權利要求1所述的一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測方法，其特征在于，其10μl逆轉錄體系如下：?5×逆轉錄緩沖液2μl，?62.5nM的特異性逆轉錄引物1μl，2.5mM的dNTP?0.5μl，200U/μl?的MMLV逆轉錄酶0.5μl，40U/μl的?RNA酶抑制劑0.2μl，1ug?樣本RNA，補充DEPC水至10μl。

4.根據權利要求1所述的一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測方法，其特征在于，逆轉錄程序如下：先將RNA與DEPC水混合，于PCR儀上預變性，70^?oC?10min，冰上靜置2min；再將其他試劑加入，于PCR儀上42^?oC?60min，70^?oC?10min。

5.根據權利要求1所述的一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測方法，其特征在于，熒光定量PCR中，20μl?PCR反應體系由下列組分構成：10μl?SYBR?Mix，10μM正向引物、反向引物各1μl，?1μl樣本cDNA，補充滅菌水至于20μl。

6.根據權利要求5所述的一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測方法，其特征在于，其PCR反應程序如下：95^oC?10min，95^oc?15sec，60^oC?15sec?，72^oC?15?sec，擴增40個循環。

7.一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有特異性miR-9逆轉錄引物，如SEQ?ID?NO.1所示；特異性的miR-9?PCR擴增引物，如SEQ?ID?NO.2和3所示；逆轉錄試劑；PCR試劑。

8.根據權利要求7所述的一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測試劑盒，其特征在于，所述的逆轉錄試劑含有5×逆轉錄緩沖液，2.5mM的dNTP，200U/μl?MMLV逆轉錄酶，40U/μl?RNA酶抑制劑以及無核酸酶的水。

9.根據權利要求7所述的一種人血漿中miR-9的熒光定量PCR的檢測試劑盒，其特征在于，所述的PCR試劑為SYBR?Mix。